氨基糖苷类药物（aminoglycosides，AGs）是一类分子结构中含有一个氨基环己醇和两个或多个氨基糖分子以糖苷键相连物质的总称，也称为氨基环醇类化合物。链霉素是于1940年从链霉菌分泌物中分离获得的第一个AGs，随即研发出卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素、庆大霉素、新霉素等，由于抗菌谱广及具有强大的杀菌活性，该类药物在畜禽养殖过程中使用较为普遍，发挥了不可替代的作用。但AGs的药残毒性也是非常大的，不仅对动物健康产生危害，影响畜牧业的发展，而且对人类健康也有一定危害。其危害性主要表现为肾毒性、耳毒性、对神经肌肉阻滞作用以及损害肠道的吸收功能等。本节综述了AGs的理化性质、药理作用、毒理与危害、国内外限量要求以及残留检测的样品前处理、仪器测定方法等内容，以期为该类药物的全面了解和残留检测提供参考。

1 理化性质

许多AGs是放线杆菌（尤其是链霉菌属和小单孢子菌属）的产物。这些菌体通常同时产生结构相似的抗生素，在临床上也是使用具有活性的混合物，如庆大霉素C主要成分是Cl、C1a、C2和C2a，卡那霉素是由卡那霉素A、卡那霉素B和卡那霉素C组成的混合物，新霉素由新霉素B和新霉素C两个立体异构体组成。部分AGs通过天然发酵产物半合成得到，如丁胺卡那霉素由天然发酵的卡那霉素A合成，双氢链霉素既可由天然发酵产生，也可由天然发酵的链霉素合成，妥布霉素可由链霉菌属发酵产生，也可由卡那霉素半合成。

按照氨基环醇结构的不同，AGs可划分为链霉胺和2-脱氧链霉胺类。除了链霉素含有链霉胺（2个氨基取代的环己六醇）外，其他AGs都具有2-脱氧链霉胺的环己六醇结构（图5-20）。根据环己醇上的取代基位置的不同，又可将2-脱氧链霉胺类细分为4，5-二取代脱氧链霉胺、4，6-二取代脱氧链霉胺及其他AGs。4，5-二取代脱氧链霉胺类有新霉素、巴龙霉素，而4，6-二取代脱氧链霉胺中则有庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素，其他AGs有链霉素、双氢链霉素、安普霉素等。壮观霉素不含氨基糖或糖苷结构，但含有氨基环醇结构。常见AGs结构式如图5-21所示。

AGs由于结构中含有多个氨基和羟基，故呈碱性，属于碱性化合物。AGs化学性质稳定，对热、酸、碱稳定，水溶性好，脂溶性差，微溶于甲醇等强极性溶剂中，在疏水性溶剂中几乎不溶。由于其含有氨基基团，其在水溶液中通常带正电荷。AGs能与无机酸或有机酸形成盐，其硫酸盐为白色或近白色结晶粉末，具吸湿性，易溶于水。

AGs结构中不含共轭双键，故仅有弱的末端吸收（低于230nm），其结构中没有特征的紫外吸收色基和荧光色基。AGs由于结构中含有较多活性基团，如多个氨基和羟基，可与衍生化试剂反应生成有紫外吸收或荧光的物质，从而进行检测。

2 药理作用

AGs的作用机理主要是抑制蛋白质的合成，作用点在细胞核糖体30S亚单位的16SrRNA解码区的A部位。研究表明:此类药物可影响细菌蛋白质合成的全过程，妨碍初始复合物的合成，诱导细菌合成错误蛋白质以及阻抑已合成蛋白质的释放，从而导致细菌死亡。AGs在敏感菌体内的积蓄是通过一系列复杂的步骤来完成的，包括需氧条件下的主动转动系统，故此类药物对厌氧菌无作用。AGs抗菌谱广，对需氧革兰氏阴性杆菌具有强大的抗菌活性，临床应用广泛，具有静止期杀菌作用，其与β-内酰胺类药物联合使用有良好的协同作用，且用药方便，价格低廉，可用于治疗革兰氏阴性菌、单胞菌属、葡萄球菌属感染等。

AGs注射给药吸收迅速而完全，口服给药不易被吸收，在胃肠道内仍具有抗菌活性，通过粪便排出。吸收的药物主要以原型药物经肾小球滤过排泄，AGs与动物组织蛋白质及大分子以离子键结合，但与血浆蛋白结合率低。AGs在动物组织中的浓度一般较低，但其在动物肾脏（尤其是皮质部）易于蓄积。

3 毒理及危害

动物源性食品中AGs残留可能会引起过敏，长期食用可能还会对第八对脑神经、听觉及肾脏产生损害。由于药物在肾脏组织中蓄积，连续用药可破坏肾组织的结构，引起肾功能障碍，尿中出现不应有的蛋白质、红细胞等，严重的可造成体内代谢产物尿素排泄障碍，引起机体内环境的紊乱，甚至引起生命危险。此外，该类药物易产生耐药性。

4 国内外限量要求

目前，欧盟明确规定，禁止使用AGs作为家畜的生长促进剂。许多国家和地区对AGs残留制定了严格的限量标准，如表5-19所示。

5 样品处理技术

动物源性食品中含有较多的干扰物质，如蛋白质和脂肪，这些物质与AGs混杂在一起，影响AGs分离与分辨，尤其在色谱分析时易导致色谱柱污染、柱压上升，严重影响色谱柱分辨率，缩短色谱柱寿命。为有效监测AGs残留，必须对样品进行前处理，除去混杂物，以免污染色谱柱和干扰AGs的分离、分析。从复杂基质中提取AGs的前处理技术常包括提取、脱脂、净化和样品浓缩等。

5.1 提取

AGs为一类水溶性、不挥发、较强极性的碱性抗生素，分子结构中含有多羟基，易与玻璃表面的硅羟基形成氢键。为避免玻璃器皿对样品的吸附，在前处理过程中宜用塑料器皿。动物源性食品中该类药物仍具水溶性质，难以用有机溶剂提取。因此从动物源性食品中提取药物时，应先用蛋白质沉淀剂或固相萃取柱除去生物组织，如蛋白质和脂肪等，以除去干扰物而改善回收率。用高或低的pH介质可有效提取生物样品中的AGs。一般采用加酸提取法，即在动物源性食品中加入三氟乙酸、三氯乙酸、高氯酸、偏磷酸等溶液，将样品与酸溶液混匀或一起均质，既可利用酸溶液沉淀蛋白质，也可以溶解AGs。Edder等用高氯酸提取动物源性食品中的链霉素，即取5g均质的组织样品，加入20mL 0.01mol/L高氯酸，均质5min，离心，取上清液过滤纸，滤液再经磺酸型阳离子柱和C18固相萃取柱净化。Viñas等检测食品中的链霉素和双氢链霉素时，在2g样品中加入0.5mol/L高氯酸溶液2mL沉淀样品中的蛋白质，经磁力搅拌器搅拌10min后，再离心10min，取上清液用饱和氢氧化钠溶液将pH调至中性，进行液相色谱分析，得到较好的回收率。Kijak等将牛奶样品于4℃离心去脂肪，加入1mL30%三氯乙酸沉淀蛋白质，离心后取上清液过C18柱净化，测定了牛奶中庆大霉素等4种成分。Kaufmann等在利用三氯乙酸沉淀肉类和肝脏样品中的蛋白质后，采用弱阴离子交换柱和阳离子交换柱净化和提取样品中11种AGs残留。刘莉治等参照日本肯定列表测定方法，以1%偏磷酸提取动物源性食品中壮观霉素、链霉素、双氢链霉素和新霉素。陈晓红、张晓燕等以庚烷磺酸钠、磷酸钠、磷酸的混合提取液提取蜂产品中残留的链霉素，高玲等则以该混合提取液提取水产品（鱼和虾）中残留的链霉素、双氢链霉素、新霉素、庆大霉素和卡那霉素。

提取AGs也可采用有机溶液提取并沉淀蛋白质，即在样品溶液中加入乙腈、甲醇/盐酸溶液沉淀蛋白质。Kowalski等用毛细管电泳检测蛋黄中的链霉素，用乙腈做提取溶剂兼蛋白质沉淀剂，回收率可达71.8%。邹月利用高效液相色谱测定蜂蜜中链霉素含量时，用酸性甲醇提取，回收率为89.0%～110%。Agarwal和Shaikh等均报道组织样品用磷酸盐缓冲液提取，离心后取上清液在弱碱性或中性条件下加热脱蛋白质的净化方法。

5.2 净化

提取液中的目标分析物浓度低，还含有许多共萃取物。如果这些物质进入系统，会增加检测的噪声，影响色谱分离，从而降低分析方法的灵敏度。把提取的样品液进一步净化，才可能有效除去提取液中的干扰组分，从而显著提高检测灵敏度。AGs残留检测中净化的主要方法有液-液萃取（LLE）、固相萃取（SPE）、基质固相分散（MSPD）、QuEChERS方法及在线痕量富集技术等。在样品前处理过程中，为了达到较好的净化效果，常常将几种方法结合使用。

5.2.1 液-液萃取（LLE）

LLE是基于分析物在有机相和水相间的分配系数不同，来实现杂质与待测药物的分离，从而达到净化的目的。

由于AGs的高极性，在酸性pH范围内不能被提取到有机相中，仍留在水相中。LLE可以将有机干扰成分从水相中直接转入有机相中，减少杂质对色谱峰的影响。Schermerhorn等用30%三氯乙酸沉淀牛奶中的蛋白质后，再分别用二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯与水相混合，进行液-液分配，去除水相中的杂质。苑丽等采用三氯乙酸抽提去除样品中的蛋白质，采用二氯甲烷去除试样中脂溶性物质，经LC-SCX阳离子固相萃取小柱净化处理，再用反相高效液相色谱配合电化学检测器直接检测动物源性食品中残留的大观霉素。张晓燕等在蜂王浆中加入庚烷磺酸钠酸性提取液和三氯甲烷，通过涡旋混合并离心取上清液，从而将有机杂质留在三氯甲烷中。王苏华等用磷酸盐缓冲液提取鸡蛋中的新霉素，用三氯甲烷进行LLE，沉淀脂溶性蛋白质，除去脂溶性干扰物。

5.2.2 固相萃取（SPE）

SPE是以液相色谱分离机制为基础建立起来的分离和纯化方法，利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，使其与样品的基体及干扰物分离，再通过洗脱液洗脱或加热解吸附等方法，得到被净化和富集的目标化合物。AGs的浓缩与净化采用阳离子交换吸附剂较为理想，如苯磺酸基阳离子交换柱、羧基阳离子交换柱。AGs在C18固相萃取小柱上不保留，但经离子交换后可保留在固相萃取柱上，故采用C18柱进行净化时，提取液中应预先加入适当离子对试剂，以提高AGs的保留能力。

Agarwal等用磷酸盐缓冲液提取动物组织中的庆大霉素，加热除去蛋白质，用硫酸将提取液pH调至6.4～6.5，用CM-sephadex离子交换柱净化，用碱性缓冲液洗脱后用Sep-Pak硅胶柱进一步纯化。方法加标回收率为86%～108%，检测限为200μg/kg。Shaikh建立了牛肾中新霉素B残留的离子交换柱净化方法。侯亚莉等用MCX固相萃取小柱净化牛肉组织提取液以测定其中的庆大霉素。

Edder等用高氯酸提取动物源性食品中的链霉素，提取液先经磺酸型阳离子交换小柱净化，用02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0）洗脱，洗脱液中加2mL0.5mol/L庚烷磺酸钠，用浓磷酸调pH至2.0，过C18固相萃取柱净化，用水和叔丁基甲基醚-正己烷（4∶1）淋洗，用10mmol/L庚烷磺酸钠甲醇溶液洗脱并吹干，用10mmol/L庚烷磺酸钠溶解定容，柱后荧光衍生HPLC测定。采用阳离子交换柱和C18固相萃取柱进行净化，使用阳离子交换柱去除样品中的极性杂质，用固相萃取柱除去样品中的非极性杂质，使链霉素富集和浓缩。王立等采用类似方法测定水产品中的链霉素。Kaufmann等利用三氯乙酸沉淀肉和肝脏样品中的蛋白质后，采用弱阴离子交换柱净化和浓缩，并经LC-MS/MS测定了生物样品中11种AGs，此方法也可用于鱼类和猪肉及牛肝中AGs的定性定量检测。姜莉等采用类似方法建立了牛奶样品中链霉素含量检测方法。

Kijak等用C18固相萃取柱净化牛奶样品，用水、水-甲醇（1∶1）和甲醇淋洗，用16%氨水甲醇洗脱牛奶中庆大霉素。Posyniak等在检测猪肉、肝和肾中庆大霉素和新霉素残留时亦采用C18固相萃取柱净化，在提取液中加入0.2mol/L己烷磺酸钠。VanBruijnsvoort等利用C18固相萃取小柱净化蜂蜜中的链霉素和双氢链霉素，链霉素和双氢链霉素的回收率分别为81%和84%。陈晓红等在检测蜂蜜中链霉素残留时也采用C18固相萃取小柱进行富集净化。Hormazabal等采用C18固相萃取柱净化、反相色谱测定牛奶、牛肉、牛肾和猪肉及猪肾中双氢链霉素时，在提取液中适量加入庚磺酸盐离子对试剂后可以提高AGs的保留时间。薛晓锋等用OasisHLB柱代替C18固相萃取柱测定了蜂王浆中链霉素残留。高玲等用HLB柱对水产品提取液进行净化。

Gerhardt等采用在线痕量富集技术对初提取液进行净化，在含离子对试剂的流动相中，采用C18固相萃取小柱对鲜奶中的链霉素和双氢链霉素进行富集，干扰组分被淋洗除去，待测物被洗脱进入分析柱中。Babin等报道利用在线反相固相萃取柱对牛肝、肾及肌肉组织中的双氢链霉素、庆大霉素和新霉素进行净化，加入离子对试剂后，目标物经C18固相萃取柱分离，采用LC-MS/MS进行检测，双氢链霉素、庆大霉素和新霉素在肾脏样品中的回收率分别为76%、57%、51%，检测限分别为0.1μg/kg、0.1μg/kg、0.4μg/kg。

5.2.3 基质固相分散（MSPD）

MSPD是Barker等在1989年提出并给予理论解释的快速样品处理技术，是一种特殊的SPE净化技术，不需要提取、溶剂转换等步骤。常用于固体和半固体样品的净化，它是将样品直接与适量固相萃取填料一起混合、研磨，使样品均匀分散于固体相颗粒表面，基于固相填料与样品中的目标化合物产生各种作用力，将目标物与样品基质分离，再用洗脱液洗脱，达到分离和富集目标化合物的目的。MPD可同时实现提取与净化，大大节省了时间，减少了溶剂的使用。

McLaughlin采用MPD提取肾脏中的AGs残留（壮观霉素、链霉素、双氢链霉素、庆大霉素C复合物、新霉素B和潮霉素B），0.5g组织匀浆与2.0g氰基（CN）吸附剂混匀后装入柱中，用正己烷、乙酸乙酯、甲醇和甲醇-水（1∶1）淋洗，最后用酸性水溶液（0.1mol/L甲酸或0.05mol/L硫酸）洗脱。Bogialli等利用MSPD，以70℃的热水作为洗脱液，洗脱牛奶中的9种AGs，再将洗脱液pH调节至4.1，过滤后进LC-MS检测。此方法回收率为70%～92%，变异系数小于11%，检测限为2～13μg/L。罗瑞峰和马小宁用酸性氧化铝基质固相分散提取猪肉中的链霉素，用正己烷-叔丁基甲醚混合液（1∶4）和甲醇洗涤，再用磷酸溶液（pH＝2.0）洗脱链霉素，加入庚烷磺酸钠溶液，混匀，过OasisHLB固相萃取柱，弃去全部淋出液。用甲醇洗脱，用氮气吹至近干，残渣用0.01mol/L庚烷磺酸钠溶液溶解，用柱后衍生高效液相色谱荧光检测，添加回收率为77.4%～86.5%，检出限为5μg/kg。

5.2.4 加速溶剂萃取（ASE）和加压液体萃取（PLE）

ASE和PLE是指在较高的温度（50～200℃）和压强（6895～20684kPa）下用有机溶剂萃取固体或半固体的自动化方法。提高的温度能极大地减弱由范德华力、氢键、目标物分子和样品基质活性位置的偶极吸引所引起的相互作用力。液体的溶解能力远大于气体的溶解能力，因此增加萃取池中的压力使溶剂温度高于其常压下的沸点。该方法的优点是有机溶剂用量少、快速、基质影响小、回收率高和重现性好。

Berrada等采用ASE提取了肌肉中的双氢链霉素、链霉素、壮观霉素和螺旋霉素，方法回收率70%～96%，检测限为1～6g/kg。

5.2.5 QuEChERS方法

QuEChERS方法是由Anastassiades等于2003年在MSPD的基础上研究建立的分散固相萃取样品前处理技术。其基本流程为：用乙腈萃取样品中的残留药物，用氯化钠和无水硫酸镁盐析分层，萃取液经无水硫酸镁和PSA（primary secondary amine，硅胶基伯胺仲胺键合相吸附剂）分散固相萃取净化后，用GC或GC-MS进行多残留分析。因分散固相萃取具有快速（quick）、简单（easy）、便宜（cheap）、有效（efective）、耐用（rugged）和安全（safe）的特点，因此他们用英文首字母将其命名为QuEChERS方法。

Wang和Leung使用QuEChERS方法建立了牛奶和蜂蜜中AGs多残留净化方法。样品以含1%乙酸的乙腈作为萃取剂，用醋酸钠、乙二胺四乙酸钠和无水硫酸镁盐析分层，不用净化，过滤后滤液用超高效液相色谱-飞行时间质谱（UPLC-QqTOFMS）进行检测分析，获得了较好的效果。

6 检测方法

6.1 微生物法

微生物法是利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，根据量反应平行线原理，比较标准品与供试品对接种试验菌产生抑菌圈的大小来定量确定残留量。AGs没有特征的紫外吸收，因此微生物法是当前各国药典测定该类药物含量的主要方法。微生物法检测成本相对低廉、操作简单、不需要特殊设备，可批量处理样品，易于推广应用。

马懿用链霉素微生物电极测定乳类食品中的链霉素，方法回收率为91.2%～109%。王苏华等以表皮葡萄球菌26069型（Staphylococcus epidermidis，ATCC 12228）为测试菌，用琼脂扩散法测定新霉素在鸡蛋中的残留，鸡蛋中检测限为0.25μg/g，在0.5μg/g和1.0μg/g添加浓度时的回收率分别为78.6%和80.5%。蔡金华等用10%的三氯乙酸提取牛奶中的链霉素，冷冻离心分离，用枯草杆菌（Bacillus subtilis，CMCC 63501）作为测试菌进行定量检测，检测限为0.10μg/mL，添加回收率为97.6%。刘兴泉以嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus sterothermophilus）为检测菌、溴甲酚紫为指示剂，采用微板检测方法进行鸡蛋中新霉素残留的检测，鸡蛋中的检测限为320μg/kg，可以实现高通量快速检测。

黄晓蓉等采用阻抗分析法快速检测牛奶中AGs残留，用嗜热乳酸链球菌作为指示菌，根据阻抗仪检测时间（DT）的产生，通过阻抗分析仪自动检测分析牛奶中AGs的残留情况。

TTC法，即利用氯化三苯基四氮唑（tripheye tetrazollium chloride，TTC）与抗生素反应的显色作用来检测抗生素残留，其原理是嗜热链球菌在牛乳中生长时会将无色的2，3，5-TTC还原为红色的三苯甲腙，当牛奶中存在抗生素时，会抑制嗜热链球菌的生长，TTC则无法被还原。黄怡君等用TTC法检测了牛奶中的抗菌药物，链霉素、庆大霉素和卡那霉素的最低检测浓度分别为660μg/kg、620μg/kg和6200μg/kg。

在实际检测中，微生物法测定的是总效价，不区分主成分和相关组分，而且存在菌种不易筛选、影响因素复杂、检测耗时长、稳定性差、精确度低、灵敏度低等缺点。

6.2 免疫分析法

免疫学技术主要是基于抗原抗体特异性识别并发生结合反应的分析检测技术，免疫分析法是近年来快速发展的一种方法，具有灵敏度高、特异性强、适用范围广、操作简便、快捷、成本低廉及现场适应能力强等优点。根据对抗原或抗体标记方法不同，免疫分析法可分为放射免疫法（RIA）、ELISA、荧光免疫分析（FIAS）、直接化学发光免疫分析等。免疫分析法已广泛用于生物样品中AGs的快速筛选。

6.2.1 免疫层析法

免疫层析法是近几年来国内外兴起的一种快速检测技术，其中最具代表性的是胶体金免疫层析法，它是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体）吸附在结合垫上，当待检样品加到试纸条一端的样品垫上后，其通过毛细管虹吸作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，胶体金本身显红色，可通过肉眼观察到显色结果。该法具有灵敏性高、特异性强、可定量分析、快速、简便等特点，适合于快速检测抗生素残留的推广应用。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。

Schnappinger建立了牛奶中链霉素与双氢链霉素免疫层析法，检测限分别为5ng/mL和2ng/mL。Verheijen等建立了初乳中链霉素和双氢链霉素残留的金标试纸条法，方法检测限分别为160ng/mL和190ng/mL。何方洋等建立了一种基于免疫胶体金技术的蜂蜜样品中链霉素快速检测方法，该方法检测灵敏度为10ng/g，样品检出限是40ng/g，单个样品检测时间为5～10min。

Watanabe等将卡那霉素与牛血清γ球蛋白偶联合成免疫原，免疫小鼠，获得单克隆抗体，以NC膜为载体，标记物为卡那霉素-辣根过氧化酶（HRP），底物为5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠，建立了卡那霉素快速检测试纸法，牛奶、牛血浆和尿及鸡血浆用缓冲液稀释后检测，方法检测限为50ng/mL。Chen等建立了卡那霉素和妥布霉素金标试纸条法，两种药物在猪肉和猪肝中的检测限为50μg/kg，猪肾的检测限为100μg/kg，在5～10min可判定结果。

Jin等采用胶体金免疫层析法、直接竞争免疫法检测牛奶中的庆大霉素，检出限为6μg/L，回收率为112%。唐慧林等采用胶体金免疫层析法，通过利用不同缓冲体系和添加不同表面活性剂处理过的样品垫进行试验，研制出适合于现场原奶AGs残留检测的快速检测试纸，庆大霉素检测条和卡那霉素检测条的灵敏度为100ng/mL，链霉素和双氢链霉素检测条的检测灵敏度为200ng/mL。

王爱萍等基于胶体金标记技术制备出了新霉素免疫膜层析快速检测试纸（图5-22），该试纸检测限为50ng/mL，与庆大霉素、链霉素、妥布霉素和紫苏霉素等其他药物均无交叉反应，其结果与高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）较一致。

6.2.2 ELISA

ELISA是使被酶标记的抗原或者抗体与被测的抗体或抗原发生结合，然后加入可以被酶催化成有色物质的底物，通过颜色的深浅进行定性或者定量分析，是目前比较常用的分析方法。该方法具有灵敏度高、特异性强、快速、简便、样品前处理简单等优点，非常适于生产或交易现场实时监控及大量样品筛查，近年来有关报道较多。

Kitagawa等早在1983年利用正-（间-顺丁烯二酰亚胺-苯甲酰基）琥珀酰亚胺（MBS）做偶联剂，将卡那霉素与牛血清白蛋白（BSA）偶联做免疫原，免疫兔得到抗卡那霉素抗体。Watanabe等将卡那霉素与牛血清γ球蛋白偶联合成免疫原，免疫小鼠，制备出了两株单克隆抗体，并选用其中一株（对卡那霉素的半数抑制浓度为2μg/L）建立ELISA试剂盒，牛奶、牛血浆和牛尿、猪血浆和猪尿、鸡血浆用缓冲液稀释后进行检测，检测限均为4ng/mL。刘丽强等用卵清白蛋白（OVA）-碳二亚胺（EDC）方法合成免疫原，制备卡那霉素的多克隆抗体，建立了间接竞争ELISA，卡那霉素的IC50为9.9ng/mL，最低检测限为1.0ng/mL，检测的线性范围为1～500ng/mL。

Schnappinger等以链霉素与BSA偶联做免疫原，免疫兔获得抗链霉素的多克隆抗体，该抗体对双氢链霉素的交叉反应率达148.7%。建立了牛奶中链霉素和双氢链霉素的直接竞争ELISA，样品经离心脱脂和PBS稀释后直接测定，检测限分别为6ng/mL和0.8ng/mL。王谦用羧基二咪唑（CDI）法合成链霉素全抗原，免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术得到了一株能稳定分泌抗链霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞。Abuknesha等用三聚氯氰通过两步法将链霉素与BSA偶联作为免疫原免疫羊，得到效价1/40000的多克隆抗体，适合检测牛奶、血清、水三种样品中链霉素残留，检测限是1ng/mL，与双氢链霉素交叉反应率是75%，而与其他AGs交叉反应很小。黄耀凌等建立了牛奶中链霉素残留量的快速筛选法，检测限可达20μg/L，200μg/L空白奶样添加回收率为60%～110%，对双氢链霉素有交叉反应[交叉反应率为100.7%]，对庆大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、西梭霉素和妥布霉素无交叉反应。范国英采用EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）一步法人工合成链霉素抗原，免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术获得了分泌抗链霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，建立了快速检测链霉素残留的ELISA，并用于猪尿液中链霉素残留检测，检测限为1μg/L；猪尿样的平均添加回收率为84.1%，除双氢链霉素（交叉反应率为104.16%）外，该试剂盒与其他抗生素类药物均无交叉反应。

Jin等用单克隆抗体直接竞争ELISA测定牛奶和血浆中的新霉素，新霉素抗体特异性较高，与其他AGs不发生交叉反应，在血浆和牛奶中的检测限分别是3.61ng/mL和273ng/mL。商艳红等利用碳二亚胺法合成免疫原（新霉素与BSA偶联物）免疫兔，获得抗体，该抗体对新霉素有很高的选择性，而对其他6种AGs均无叉反应。以此抗体建立了鸡组织中的新霉素残留，样品用三氯乙酸提取离心后，用PBS液稀释，添加回收率均为71.8%～97.8%。Wang等用ELISA检测动物源性食品中的新霉素，猪肉、鸡肉、鱼和牛奶样品的检测限是5μg/kg，肾脏是10μg/kg，鸡蛋是20μg/kg；回收率为75%～105%，与其他AGs均没有交叉反应。

Chen等建立了一种快速、灵敏地检测猪组织中庆大霉素的ELISA，肌肉、肝脏、肾脏中庆大霉素的检出限分别为6.2μg/kg、3.6μg/kg、2.7μg/kg，抗体与其他AGs无交叉反应；完成测试仅需45min，十分方便快捷。Jin等研究出一种与其他抗生素不产生交叉反应的庆大霉素检测方法，其在动物血浆中的检测限为1.0μg/L，在牛奶中为0.5μg/L，在动物血浆和牛奶中的回收率为85%～112%。

Haasnoot等建立了检测牛奶和肾中庆大霉素、新霉素、链霉素、双氢链霉素残留的双抗夹心ELISA，分别将4种药物与BSA偶联合成人工抗原，制备兔抗血清。牛奶样品脱脂，肾脏组织用3%三氯乙酸除去蛋白质，提取滤过后用缓冲液稀释，牛奶和肾脏中的检测限分别为10μg/L、50μg/kg。王忠斌等以新霉素的降解产物新霉胺作为半抗原，采用戊二醛法合成新霉胺免疫原，制备出针对多种AGs的多克隆抗体。使用高碘酸盐法制备新霉胺的酶标抗原，建立AGs的直接竞争ELISA，新霉素、庆大霉素和卡那霉素的检出限分别为200μg/kg、150μg/kg和350μg/kg。

尽管免疫分析法存在灵敏度高、快速、简便等优点，但在免疫分析过程中出现的交叉反应易导致检测的可靠性降低，且影响抗生素残留免疫分析的因素较多，从而导致结果存在不稳定，难于实现方法的标准化等，因此药物残留的免疫学技术在实际应用过程中仍存在一定的局限性。

6.2.3 生物传感器技术

生物传感器以生物学敏感元件作为主要功能组件，并与各种转换器相连接，敏感元件识别目标物并与之发生反应，经各种转换器测量或者按照一定规律将其转换成可识别信号，再经电子仪器设备对信号进行处理。免疫传感器是生物传感器的一种。传感器的生物敏感层与复杂样品中特定的目标分析物之间通过抗体与抗原之间的识别反应，产生一些物理化学信号（如光、热、声、质量、颜色、电化学等）的变化，这些变化通过不同原理的传感器（如光敏感、压电装置、光极、热敏电阻、离子选择性电极等）被转换成第二信号（常为电信号），经放大后被显示或记录。利用兽药与特异性抗体结合反应特性研制出的免疫传感器，可用于对相应兽药残留进行快速定量定性检测。

2001年Baxter等用光学生物传感器检测巴氏灭菌全脂奶中的链霉素。用链霉素-己二酰肼与牛甲状腺球蛋白偶联后免疫绵羊制备多克隆抗体，该抗体与双氢链霉素的交叉反应率为106%，与其他抗生素没有交叉反应。链霉素多克隆抗体被固定在传感器芯片上，链霉素也被固定在CM5传感芯片上，使未经脱脂和离心处理的牛奶流过芯片，整个检测时间为5min，检测限为4.1μg/L。Ferguson等又将该技术用于牛奶、蜂蜜、猪肾和猪肉中链霉素和双氢链霉素的检测。牛奶样品不需前处理，蜂蜜样品只需用缓冲液简单稀释，猪肾和猪肉样品用水溶液提取后离心。方法的检测限分别为牛奶30μg/kg、蜂蜜15μg/kg、猪肾50μg/kg、猪肉70μg/kg，方法回收率为77%～110%。Haasnoot等利用抗链霉素的单克隆抗体（4E2）和抗双氢链霉素的单克隆抗体（4G8）建立了光学生物传感器，用免疫测定法检测牛奶中链霉素和双氢链霉素残留，两种药物残留的检测限均为20μg/L。

Haasnoot等于2001年报道用传感器芯片将庆大霉素单克隆抗体固定到光学生物传感器上，缓冲液和牛奶中的半数抑制浓度分别是20μg/L和30μg/L，低于欧盟MRL100μg/L；Khaldeeva等利用安培酶联免疫传感器检测牛奶中庆大霉素，生物传感器部分同时固定胆碱酯酶和庆大霉素抗体，方法检测限为0.001μg/L，检测时间不超过20min。

Wu等建立了纸支持免疫传感器（paper supported immunosensor），并用于分析牛奶中的新霉素，方法检测限为0.04μg/L，添加回收率为93.2%～104.7%。Chen等建立了以磁松弛开关（magnetic relaxation switch）分析和生物素-链霉亲和素系统为基础的免疫传感器，并用于牛奶中卡那霉素残留分析，方法检测限为0.1μg/L，添加回收率为80.2%～85.6%，在45min内可完成检测。

Haasnoot等报道了用光学生物传感器免疫分析法检测复原脱脂乳中链霉素、双氢链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素5种AGs。将芯片微刻4个连续微通道，庆大霉素、新霉素、卡那霉素及链霉素衍生物通过胺键结合被固定在CM5传感芯片上作为包被抗原，将待检样品和特异性抗体混合反应，10倍稀释后通过自动加压装置注射入坑道，样品中的AGs与固定通道中的AGs竞争抗体，通过电压变化检测样品中AGs含量，检测限为15～60μg/L，低于MRL，分析时间约7min。Knecht等报道了用传感器法检测牛奶中链霉素、庆大霉素和新霉素等10种兽药，这是一种多组分免疫传感间接竞争ELISA，对多种药物同时检测、单独分析，检测速度快，大约需要5min。新霉素的检测限是32μg/L，庆大霉素、链霉素检测限远低于欧盟MRL。Rebe等建立了基于椭圆光度法成像原理的微阵列生物传感器，并用于牛奶中新霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、磺胺甲基嘧啶、氯霉素、恩诺沙星等兽药残留检测。

生物传感器技术大大地简化了动物源性食品中药物残留的检测方法，不仅缩短了分析时间、提高了灵敏度，而且便于实现自动化及现场检测，是一种应用前景广阔的快速检测技术。但是由于受到生物传感器的稳定性、灵敏性、重现性和使用寿命等诸多因素的限制，再加上样品的成分复杂且差异较大，该技术在实际应用中还有许多局限。

6.2.4 放射免疫法（RIA）

RIA利用放射性同位素标记的药物与样品中残留的药物竞争性结合有特殊位点的受体或抗体，受体存在于微生物细胞表面并被添加到样品中，利用液体闪烁仪计数，通过检测放射性同位素标记的药物量，推算出样品中残留的药物含量。Oka等采用放射化学法进行检测研究，结果发现庆大霉素在牛奶和组织中的检测限分别为20μg/L和400μg/kg，而链霉素在鱼和鸡蛋中的检测限可达150μg/kg。秦燕等采用RIA检测鸡肝中链霉素残留，筛选水平为200μg/kg，对双氢链霉素的交叉反应率不到1%，前处理简单、分析速度快。龙朝阳等利用该方法筛选了猪肉中的AGs，放射标记的药物和样品中的残留药物竞争性结合特殊的细胞受体部位，样品经离心除去上清液（含未能与结合位点结合的标记药物），沉淀在闪烁液中重新悬浮，用CharmⅡ放射免疫仪测量放射强度。

与ELISA比较，RIA前处理简单、快速，可用于动物源性食品中AGs的快速检测，但由于存在放射性污染，试验操作难于控制，费用较高，在实际工作中很少应用。

6.3 薄层色谱法（TLC）

TIC是将支持物均匀涂布于板上形成薄层，然后用相应的溶剂展开，通过在吸附剂和展开剂之间的多次吸附-溶解作用，将混合物中各组分分离成孤立的样点，从而实现分离混合物目的的一种定性检测方法。TLC具有操作简单、适用性广、灵敏度高、快捷、成本低等特点，在AGs的鉴别及有关物质检查中占有主要地位，已成为重要的抗生素类药物残留筛选方法之一。正相和反相TLC均能用来检测链霉素、卡那霉素、庆大霉素和妥布霉素等，检测限可达0.4～0.6μg/kg。AGs为极性较强的碱性化合物，在使用硅胶作薄层色谱的固定相时，展开剂中需要加入氨水调节pH以减少拖尾现象。由于其结构中具有伯氨基，显色剂中常用含有与伯氨基发生显色反应的茚三酮。

6.4 毛细管电泳（CE）

CE是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异而进行分离的一类检测技术。CE常见的分离模式是毛细管区带电泳（CZE）和胶束电动毛细管电泳色谱（MEKC），具有高效、快速、消耗溶剂量小、样品用量少、易于自动化等优点。利用CE处理痕量级的残留样品时，由于取样量少，可能会存在灵敏度不够高的缺点。由于AGs具有极好的水溶性，并带正电荷，故较适宜用CE进行分析。但其分子结构中不具有合适的生色团，故选择适当的检测手段十分重要。

Flurer采用硼酸盐缓冲系统在UV195nm波长下直接检测，12种AGs（丁胺卡那霉素、贝卡那霉素、布替罗星、地贝卡星、双氢链霉素、庆大霉素、卡那霉素、巴龙霉素、核糖霉素、西索米星、链霉素、妥布霉素）可被分离。Kowalski等使用CZE法检测了鸡蛋中链霉素的残留，以未涂层石英毛细管为分离柱，采用30mmol/L磷酸二氢钠＋5mmol/L硼酸＋5mmol/L硼酸钠为缓冲液，在UV220nm波长下检测，检测限为160μg/kg。Kowalski等使用CE紫外检测法测定猪和鸡组织（肝、肾、肌肉）9种药物（包括链霉素和双氢链霉素），在碱性条件下组织样品用乙腈或乙酸乙酯提取，方法检测低于20μg/kg。，

采用CE检测AGs时，检测器的选择对物质的分离有着重要影响，其中激发荧光检测器（LIF）的灵敏度最高。Serrano和Silva采用CE-LIF法检测牛奶中卡那霉素B、阿米卡星、新霉素B、巴龙霉素Ⅰ，经过硫代靛青琥珀酰亚胺酯（Cy5NS）衍生化，用MEKC分离、LIF检测，方法检测限为0.5～1.5μg/kg。余长柱等采用50mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.0）＋0.5mmol/L十六烷基三甲基溴化铵溶液为分离缓冲液，组织样品用10%三氯乙酸提取滤过后在－15kV下分离，与柱后衍生试剂1.0mmol/L萘二醛＋8.0mmol/L 2-巯基乙醇＋35mmol/LNa2B4O7（pH10.0）的30%（V/V）甲醇溶液反应，激发诱导荧光检测器于473nm处检测，卡那霉素A、妥布霉素、阿米卡星检出限分别为36μg/kg、42μg/kg、52μg/kg，回收率为90.2%～95.3%（图5-23）。此方法也可用于牛奶中卡那霉素A、妥布霉素、阿米卡星残留分析（图5-24）。

6.5 气相色谱（GC）

GC分离能力强、分离效率高，适合于易挥发、热稳定的物质分析。由于AGs的亲水性和难挥发性，不能直接用GC进行分析，需要用硅烷化试剂对氨基和羟基衍生化后才能进行分析。Mineo等将肉样匀浆后，用10%三氯乙酸提取去蛋白质。粗提取液经amberliteXAD-2柱和活性炭柱净化，用N，O-双（三甲基硅烷基）乙酰胺（BSA）-三甲基硅烷咪唑（TMSI）-三甲基氯硅烷（TMCS）（1∶1∶1）等量混合物衍生、氢火焰离子化检测器检测，肉中AGs回收率为82%～94%，检测限为25～50μg/kg。Preu等用三甲基硅烷咪唑（TMSI）和N-七氟丁酰咪唑（HFBI）为衍生化试剂，通过两步衍生化测定庆大霉素和卡那霉素，用气相色谱-电子捕获检测器（GC-ECD）检测、质谱法确证。结果发现庆大霉素可分离出C1、C1a、C23种成分，可测定30～200μg庆大霉素和10～200μg卡那霉素。Preu又采用GC-MS测定了样品中的双氢链霉素，该方法的灵敏度高，可达到残留检测分析的要求。陶燕飞等用提取液提取后，过OasisHLB柱净化，用甲醇洗脱并吹干，用N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）衍生，吹干后用正己烷溶解定容、氮磷检测器检测，组织中添加大观霉素定量限为40μg/kg。在组织中添加40～10000μg/kg大观霉素，回收率为73.2%～85.7%。

6.6 高效液相色谱（HPLC）

HPLC常用于难挥发、强极性物质的分离检测，具有专一性强和灵敏度高等特点。AGs由氨基糖与碱性1，3-二氨基肌醇以苷键结合而成，1，3-二氨基肌醇为碱性多元环己醇结构，因此AGs均具有水溶性好、碱性强、极性大且相对分子质量高等特点，特别适合于HPLC检测。由于AGs没有特征的紫外吸收和荧光发光基团，常根据其分子中的活泼基团（如氨基和羰基）与衍生化试剂反应生成有紫外吸收或有荧光的物质，进行紫外检测或荧光检测。

AGs中的氨基虽然亦可和固定相表面的硅羟基相互作用，但由于其分子极性相对较强，在一般C18柱上不易保留，故多选用离子对试剂（庚烷磺酸钠、三氟醋酸、七氟丁酸酐），离子对试剂和氨基的相互作用抑制了氨基和固定相表面的硅羟基的作用，在试验中也很少观察到色谱峰拖尾或前延的现象，所以不用特别选用钝化硅羟基活性的色谱柱。检测AGs大多采用反相色谱或离子对色谱系统。

AGs在低pH条件下为极性较强的碱性化合物，因此一般用强离子交换柱进行分离，可提高检测的精确度、稳定性和重复性。

大多数检测方法均为衍生化法，邹月利报道了以甲醇-乙腈-0.1mol/L草酸为流动相、以C18柱为固定相，用HPLC（365nm）直接检测蜂蜜中链霉素含量，方法检测限为10μg/kg，回收率为89.0%～110%。部分动物源性食品中AGs残留的液相色谱分析方法见表5-20。

6.6.1 衍生化法

由于AGs缺乏紫外吸收和荧光发光基团，因此直接利用紫外或荧光检测器检测效果不理想。根据衍生反应在分离前、后的不同，可分为柱前衍生和柱后衍生两种方法。

6.6.1.1 柱前衍生化法

柱前衍生化法的特点是较简单、不受流动相限制、反应不受分离时间控制，且不需要特殊的设备。常用的柱前衍生化试剂有邻苯二甲醛（OPA）、β-萘醌-4-磺酸、β-萘醌-4-磺酸盐（NQS）、1-氟-2，4-二硝基苯、2，4，6-三硝基苯磺酸、3，5-二硝基苯甲酰氯以及氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）。NQS衍生链霉素和双氢链霉素的胍基，OPA或FMOC-Cl衍生AGs的氨基。

Agarwal报道了动物组织中庆大霉素的柱前衍生测定法，以OPA为衍生剂，荧光检测（λex340nm，λem418nm），方法检测限为200μg/kg。Fennell等用KH2PO4-Na2SO4溶液（pH8.8）提取牛奶和动物组织中庆大霉素，OPA衍生化，HPLC-UVD检测（330nm），庆大霉素4种异构体分离较好，方法检测限分别为0.6μg/L和1μg/kg，回收率大于90%。Sweeney报道了猪肾中安普霉素的测定方法，安普霉素经OPA柱前衍生后，以5mmol的醋酸胺溶液-醋酸-乙腈（60∶2∶40）为流动相、Nova-PakC18为色谱柱，荧光检测（λex230nm，λem389nm），组织中残留的检测限达到了23ng/mL，回收率为76%～86%。

Reid等采用弱阳离子交换柱进行样品预处理，FMOC-CI衍生，以SupelcosilLC-304（C4柱）为色谱分离柱，以11mmol/L磷酸钠（pH＝50）-乙腈（37∶63，V/V）为流动相，HPLC-荧光检测（λex260nm，λem315nm）测定了肌肉和肾脏中的新霉素，肌肉组织回收率为80%～120%，肾组织回收率为80%～100%，肌肉和肾的检测限分别是125μg/kg和200μg/kg，定量限分别为250μg/kg和500μg/kg。如果采用不同的SPE小柱，不同的淋洗和洗脱溶液，应该采用适合的衍生方法。Posyniak等在检测猪肉、肝和肾中庆大霉素和新霉素残留时用FMOC-Cl柱前衍生化，HPLC-FD检测（λex260nm，λem315nm），庆大霉素和新霉素的检测限分别是50μg/kg和100μg/kg，定量限分别是100μg/kg和200μg/kg，回收率分别是76%～86%和77%～83%。侯亚莉等以乙腈-水（85∶15，V/V）为流动相，用荧光检测器（λex260nm，λem315nm）测定经FMOC-Cl柱前衍生化，正己烷脱脂牛肉中残留的庆大霉素，回收率为80.4%～82.8%，检测限为25μg/kg，定量限为50μg/kg。由于流动相中没有使用离子对试剂，庆大霉素不同组分的色谱峰未能完全分开。FMOC-Cl的水解产物与衍生物具有相似的荧光强度，过量的衍生剂在检测前需要除去。

董晓庆等用三氯乙酸沉淀蛋白质，ODS-C18柱净化，NQS柱前衍生化，采用HPLC-UVD检测（252nm），肌肉、肝脏和肾脏中链霉素检测限分别为120g/kg、123g/kg和218g/kg。

6.6.1.2 柱后衍生化法

柱后衍生化法是试样经分离柱后，衍生化试剂在线加到流动相中，经过反应池反应后用检测器检测的方法。相对柱前衍生化，柱后衍生化则采用在线技术，便于实现自动化，且具有重现性好、试样前处理时间减少等特点。其缺点是：①需要特殊的衍生化反应装置；②过量衍生剂会干扰检测；③衍生反应必须是快反应。用于柱后衍生化的试剂通常也是OPA、NQS等。

Shaikh以OPA为衍生剂，用离子对反相液相色谱-荧光检测（λex340nm，λem445nm）法测定了牛肾中的新霉素，该方法也可以用于牛肉、牛肝和牛奶中新霉素的检测。Kijak以Spherisoub ODS2柱为分离柱，以水-甲醇（82∶18）（含0.1%醋酸、5.6mmol/L硫酸钠和11mmol/L戊烷磺酸钠）做流动相，OPA柱后衍生，荧光检测（λex340nm，λem430nm），测定了牛奶中庆大霉素的4种主要成分Cl、C1a、C2、C2a，检测限为15μg/kg，回收率为72%～88%。Hornish等用三氯乙酸和二氯甲烷混合溶剂提取牛组织中的链霉素，用SPE净化，OPA柱后衍生化，HPLC-FD检测（λex340nm，λem445nm），牛肾检测限为50μg/kg，肝、肌肉和脂肪中检测限均为100μg/kg。

农业部公告1025号公布了《牛奶中Ags多残留监测柱后衍生高效液相色谱法》，采用C18固相萃取，梯度洗脱和以阳离子交换柱为液相分析柱，并用OPA进行柱后衍生。

钱疆等建立了高效液相色谱荧光检测乳制品中的9种AGs（链霉素、双氢链霉素、新霉素、壮观霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、阿泊拉霉素、妥布霉素、萘替米星）残留方法。样品用10%三氯乙酸提取，采用MCX固相萃取小柱净化，用StarPR-18eC18柱色谱分离，流动相采用乙腈-庚烷磺酸钠缓冲溶液梯度淋洗，柱后用次氯酸钠溶液氧化，OPA衍生，荧光检测（λex340nm，λem435nm）。9种AGs加标回收率为69.8%～110.2%，壮观霉素、链霉素、双氢链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、阿泊拉霉素、妥布霉素、萘替米星、新霉素的定量限为8～40μg/kg。壮观霉素结构为仲胺，不含有伯胺基，而OPA衍生只能衍生伯胺，因此OPA衍生前先采用次氯酸钠溶液将壮观霉素的仲胺基在线氧化为伯胺基（图5-25、图5-26和图5-27）。

1994年Gerhardt等采用阳离子固相萃取柱净化样品，NQS柱后衍生，用液相色谱荧光检测法测定了动物组织和牛奶中链霉素和双氢链霉素残留。Abbasi报道了牛奶、肾和肌肉中双氢链霉素的测定方法，用辛基磺酸盐作为离子对（pH32）-乙腈（68∶32），衍生剂为NQS，荧光检测（λex270nm，λem420nm），方法检测限：牛奶为10μg/kg，肾、肌肉为15μg/kg。

Edder等以HpersilBDS为色谱柱，以10mmol/L庚烷磺酸钠、0.4mmol/LNQS的水溶液-乙腈（97∶3）为流动相，以0.2mol/L氢氧化钠为柱后反应液，HPLC-FD检测（λex260nm，λem435nm），测定动物源性食品中的链霉素，检测限：蜂蜜为5μg/kg、牛奶和肌肉为30μg/kg、肾和肝脏为100μg/kg。周萍等采用类似方法测定了蜂王浆中链霉素的残留量，方法回收率为74.7%～95.3%，检测限为5μg/kg；姜莉和赵守成建立了鲜奶中链霉素的检测方法，方法检测限为5μg/kg，回收率为78.3%～80.2%；罗瑞峰和马小宁测定了猪肉中的链霉素，方法回收率为77.4%～86.5%，检测限为5μg/kg。王立等以含10mol/L庚烷磺酸钠和04mol/LNQS的乙腈水溶液（30∶70）为流动相，以02mol/L氢氧化钠为柱后反应液，以Hypersil柱为色谱柱，荧光检测器检测（λex263nm，λem435nm），测定水产品中的链霉素，检测限为10μg/kg。薛晓锋等以AtlantisHILICSilica亲水柱为色谱柱，以0.2%酸性水溶液（内含0.052g/L1，2-萘醌-4-磺酸钠）和乙腈为流动相，梯度洗脱，采用柱后衍生（0.2mol/L氢氧化钠溶液为衍生剂）、梯度洗脱和荧光检测（λex263nm，λem435nm）分析蜂王浆中的链霉素残留。添加回收率为71.7%～77.4%，方法检出限为10μg/kg。

陈晓红等以混合提取液提取，选用50%三氯乙酸作为沉淀剂，直接过C18固相萃取小柱进行富集净化。在HypersilODS柱上以0.01mol/L庚烷磺酸钠-乙腈（65∶35）为流动相，以采用氢氧化钠和NQS双试剂柱后衍生化，以荧光检测器（λex263nm，λem447nm）检测蜂蜜中链霉素的残留量，方法检测限为20g/kg，添加回收率为87.9%～93.8%。

6.6.2 电化学检测法

由于AGs的氨基具有电活性，因此电化学检测器可用于这类化合物的检测。常用的电化学方法是脉冲电化学法。脉冲电化学法是一种无须衍生化过程、可直接检测的方法，即在高pH溶液中，含脂肪氨基和羟基的化合物在金电极上发生氧化。脉冲电化学法的色谱分离阶段需要在酸性环境中进行，而检测阶段需要在高pH环境中，所以一般在柱后需要加入氢氧化钠等强碱性物质，将流动相pH调至碱性。

Schermerhorn等用带有电化学检测器的HPLC来检测牛奶中的壮观霉素残留。苑丽等采用三氯乙酸提取并去除样品中的蛋白质、二氯甲烷去除试样中脂溶性物质，经LC-SCX阳离子固相萃取小柱净化处理，再用反相HPLC配合电化学检测器直接检测动物源性食品中残留的大观霉素。流动相为离子对缓冲体系（0.02mol/L柠檬酸-0.004mol/L庚烷磺酸钠，50%氢氧化钠调pH至6.10）-乙腈（体积比为92.5∶7.5），流速0.6mL/min，工作电极电压1.0V，柱温35℃，检测波长254nm。大观霉素在0.01～10.09μg/mL内线性关系良好，结果表明，猪、鸡肌肉、脂肪中的检测限为100μg/kg，肝脏、肾脏中的检测限为200μg/kg，均低于MRL。各添加浓度回收率为71.38%～94.81%，方法的批内变异系数为4.19%～9.86%，批间变异系数为4.86%～12.99%。

6.6.3 脉冲安培检测法

官斌等采用离子交换色谱分离，用脉冲安培器检测牛奶中的新霉素，采用三氯乙酸沉淀蛋白质，用弱阳离子交换固相萃取柱富集净化处理样品，牛奶中新霉素在10～160ng/mL添加水平的回收率为50.3%～76.9%。蔡玉娥等用离子交换柱分离AGs妥布霉素、新霉素B和西梭霉素，并用脉冲积分安培电化学检测器进行检测，该方法对妥布霉素、新霉素B和西梭霉素的检出限分别为8ng/mL、5ng/mL和47ng/mL，该方法应用于市售鲜奶的检测，3种AGs的回收率为850%～985%。

6.7 质谱法

色谱-质谱联用法是对复杂样品进行定性、定量分析的最佳方法。串联质谱（MS/MS）在单极质谱给出化合物相对分子质量的信息后，对准分子离子进行多极裂解，获得丰富的化合物碎片信息，更加精确地确认和定量目标化合物，它可应用于复杂背景下目标化合物的准确鉴定。在兽药残留检测应用中，由于目标物浓度低、样品基质复杂，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术已成为残留分析的主要发展方向。

采用LC-MS接口或电离技术有热喷雾（TSI）、传送带、离子喷雾（ISI）、电喷雾电离（ESI）、大气压化学电离（APCI）等。热喷雾法适于溶液中呈离子态的AGs，但要求流动相的离子强度尽可能小，而有机溶剂的比例要尽可能大，这不利于采用离子对色谱分离分析AGs。因此在实际操作时，离子对试剂的浓度必须仔细优化以免对质谱造成影响。同时因AGs结构中含有多个伯胺或仲胺基团而呈弱碱性，在质谱上有较强的正离子响应，采用正离子检测方法能比采用负离子检测方法得到更高的灵敏度。对于复杂样品，选择离子检测方法不一定有效，而MS/MS可提高选择性和灵敏度。

McLaughlin等报道了牛肾脏中6种AGs（链霉素、双氢链霉素、新霉素B、庆大霉素C、壮观霉素和潮霉素B）的HPLC-MS/MS测定方法。采用MSPD提取样品中的AGs，以妥布霉素作为内标物，APCI-MS/MS定量测定。母离子分别为：壮观霉素[M＋H2O＋H]＋m/z351、潮霉素B[M-2H]2＋m/z265、链霉素[M＋H2O＋2H]2＋m/z301、双氢链霉素[M＋2H]2＋m/z293，主要子离子是通过糖苷键断裂而产生的。方法回收率为25%～87%，检测限：新霉素B60μg/kg、庆大霉素C30μg/kg、双氢链霉素100μg/kg、链霉素130μg/kg、潮霉素B340μg/kg、壮观霉素520μg/kg。Hornish等建立了牛组织（肝、肾、肌肉、脂肪）中链霉素的HPLC-APCI-MS/MS确证方法，链霉素分子离子m/z333，子离子为m/z98、m/z116、m/z158和m/z189，其中m/z189用于定性，方法检测限为100μg/kg。

Carson等报道了基于离子对色谱净化牛奶样品中壮观霉素的离子阱LC-ESI-MSMS测定方法。方法采用子离子扫描的方式，监测由[M＋H]＋产生的子离子，但方法的稳定性较差。Heller等进一步研究了牛奶中庆大霉素和新霉素，他们把净化柱改为弱阳离子交换柱，而定性的方法也是采用子离子扫描的方式。

Kwork等用盐酸提取牛奶和肾脏组织中AGs，SPE净化去除牛奶中的蛋白质，以ZorbaxRxC8柱为色谱柱，用含离子对的乙腈-水梯度洗脱，用HPLC-ESI/MS/MS同时测定样品中的链霉素、双氢链霉素、新霉素、庆大霉素、安普霉素和壮观霉素等残留，线性范围为0.05～10g/mL，回收率为60%～80%。VanBruijnsvoort等用含有庚烷磺酸钠的磷酸盐缓冲液提取牛奶和蜂蜜中的链霉素和双氢链霉素，用SPE净化、LC-MS/MS测定。链霉素和双氢链霉素的质谱图相似，碎片离子m/z为263、246、221、176和m/z407丰度高，而m/z263用于监测和定量，m/z246产生的比率用于定性，链霉素和双氢链霉素的分子离子分别为m/z582.1和m/z584.2。蜂蜜和牛奶中链霉素的定量限分别为2μg/kg和10μg/kg，双氢链霉素的定量限则分别为5μg/kg和1μg/kg。Kaufmann等建立了动物肌肉和肝脏中11种AGs的LC-MS/MS测定方法，样品用三氯乙酸提取，经阴离子和阳离子交换柱净化，方法检测限为15～40μg/kg。

Heller等用三氯乙酸溶液沉淀牛血清牛奶和牛尿样品中的蛋白质，用C18柱净化，用LC-MS/MS检测，3种样品中庆大霉素的定量限分别为3.3μg/L、4.5μg/L和3.8μg/L。Bogialli等用基质固相分散提取牛奶中9种AGs，流动相中以七氟丁酸为离子对试剂，LC-MS/MS（ESI）测定，MRM监测，选择至少2个离子对（壮观霉素m/z351＞315、333，双氢链霉素m/z293＞176、409，链霉素m/z308＞176、263，安普霉素m/z271＞163、217，庆大霉素C1am/z226＞129、322，庆大霉素C2和C2am/z233＞126、143、322，庆大霉素C1m/z240＞139、157、322，新霉素Bm/z308＞161、455）作为定量依据，定量限2（安普霉素）～13（链霉素）μg/L。Babin和Fortier报道了一种灵敏的LC-MS/MS，用于测定牛肾、肝和肌肉中的双氢链霉素、庆大霉素C1和新霉素，方法检测限为0.1～0.4μg/kg。

Zhu等利用LC-ESI-MSMS测定13种AGs在动物源性食品中的残留情况发现该方法表现出了良好的回收率、精确率、稳定性、特异性和灵敏度，非常适用于动物源性食品中AGs的残留分析检测。国家发布实施的GB/T21323—2007就是用高效液相色谱-质谱/质谱法测定动物组织中多种AGs（壮观霉素、潮霉素B、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、安普霉素、妥布霉素、庆大霉素和新霉素）的残留，采用磷酸盐缓冲液提取，用C18固相萃取净化，使用七氟丁酸为离子对试剂，用高效液相色谱-质谱检测，外标法定量。

刘晓茂等采用苯磺酸固相萃取柱和C18固相萃取柱串联净化以及LC-MSMS测定了蜂蜜中链霉素和双氢链霉素。该方法链霉素的检测限为2μg/kg，双氢链霉素的检测限为1μg/kg，回收率为78%～95%。Granja等用LC-MS/MS检测了蜂蜜中的链霉素，回收率为100%，检测限为3μg/kg。陈凌云等首次使用亲水性色谱柱测定蜂蜜中的链霉素，以水（含5mmol/L乙酸铵和0.1%的甲酸）-乙腈（40∶60）为流动相，应用正离子电喷雾电离，MRM方式监测，利用保留时间和碎片信号比值判断定性结果，分子离子峰[M＋H]＋582.1在产物离子扫描质谱图中，m/z263.2和m/z264.3的碎片离子响应最高，MRM方式监测的离子对为m/z582.1＞263.2和m/z582.1＞264.3，蜂蜜中链霉素的检测限为1.05μg/kg。

孙雷等采用KH2PO4溶液（含0.4mmol/L EDTA和2%TCA）提取，用CBX柱固相萃取、10%乙酸甲醇溶液洗脱，用易挥发的七氟丁酸作为离子对试剂，用MS/MS检测了8种AGs残留，检出限为5μg/kg，平均回收率为83.0%～114.1%。刘莉治等以偏磷酸提取、C18固相萃取小柱净化浓缩后，使用七氟丁酸离子对试剂作为流动相，用UPLC-MS/MS测定动物源性食品中壮观霉素、链霉素、双氢链霉素和新霉素药物残留。4种AGs在80～2000μg/L浓度内呈现良好的线性关系，壮观霉素、链霉素、双氢链霉素方法检测限为8μg/kg，新霉素方法检测限为16μg/kg，添加浓度回收率为67%～93%。