近日，泰国Vidyasirimedhi 研究所的P. Chaiyen教授在顶级期刊Angewandte上在线发表了重要研究成果，报道了全新的类荧光素的合成方法，并基于此荧光素开发出了有机磷农药的原位检测技术—LUMOS技术，磷的检出水平达到万亿分之一(ppt)级别。

【研究概要】

摘要:D-荧光素(D-LH2)是萤火虫荧光素酶(Fluc)的基底物，在生物发光方面有着广泛的应用。本文报道了一种绿色的新方法，利用酶促反应(HELP, HadA酶促荧光素制备)将19个酚类衍生物转化为8种D-LH2类似物，产率为51%。该方法合成出了全新的产物：5 ' -甲基-D-LH2和4 '，5 ' -二甲基-D-LH2，它们在自然界中从未被合成或发现过。性能分析结果显示，5 ' -甲基-D-LH2发出的光比D-LH2更亮、波长更长。利用酶促反应HELP，我们进一步开发了LUMOS (Luminescence Measurement of organphosphate and Derivatives)技术，对有机磷农药进行原位检测分析。采用的磷农药包含：对硫磷、甲基对硫磷、EPN、丙溴磷和杀螟硫磷在内的类有机磷农药(OPs)。通过借助有机磷农药水解酶与萤火虫荧光素酶的耦合反应，LUMOS原位检测技术可以检测到这些磷农药的万亿分之一(ppt)水平。而且，LUMOS技术方法可不经过任何前处理步骤，就可以直接检测食品和生物样品中的有机磷。

【研究背景】

荧光素酶催化的生物发光是生物医学研究以及食品和环境中毒物检测的一种强有力的分析方法。大约30%的高通量筛选(HTS)实验采用生物发光检测。虽然存在多种荧光素酶，但以d -荧光素(D-LH2)为底物的萤火虫荧光素酶(firefly萤光素酶，Fluc)因其高量子产率而成为最常用的荧光素酶系统之一，其最大发光波长(λmax)为560 nm。对D-LH2进行改性，获得更亮、更长的发光波长(>600 nm)的类似物，是拓展和提高D-LH2应用范围的创新发展的关键。

【图文解析】

图1 合成路线

如图1所示，制备荧光素的HadA酶(HELP)反应包括耐热HadA、黄素还原酶(C1)和辅助酶，在温和条件下可在水溶液中合成d -荧光素类似物。结合对硫磷水解酶(Opd)和Fluc的反应，LUMOS(有机磷及其衍生物的发光测量)平台可以检测OPs家族的农药(对硫磷、甲基对硫磷、EPN、丙硫磷、以及除虫硫磷)及其代谢物通过生物发光在生物和食物样本中以万亿分之一(ppt)的水平特异性和定量地存在。

图2 酚类衍生物生物转化为D-LH2类似物的研究

图2所示，酚类衍生物生物转化为D-LH2类似物的研究。a)酚类底物(1)转化为苯醌衍生物(2)的HELP反应综述。D-Cys的加入可生成D-LH2类似物。b)酚类衍生物(1个c-1s)，可作为HadA酶生成D-LH2类似物的底物。[a]可转化为化合物2的化合物。除1p外，其余化合物的产率均为100%。[b]有机磷农药(OPs) (1a、1f和1k)和有机氯除草剂(1b和1l)的代谢物苯酚衍生物。c)酚类衍生物可转化为D-LH2类似物(2a-2h)的结构。[c] Novel D[1]LH2类似物是5 ' -MeLH2， (2g) 和4 '，5 ' -DiMeLH2 (2h)。[d] d - lh2类似物的最大生物发光波长。

图3：1H-NMR核磁数据结果

图4 传统D-LH2与本研究产物性能对比结果

图4所示，Photinus pyralis萤火虫荧光素酶(Fluc)与D-LH2和D-LH2类似物的反应，2a-2h。a) pH 8.0时，天然D-LH2 (2a)和红移D-LH2类似物(2c、2g和2h)在Fluc作用下的生物发光光谱。2a的生物发光波长为560 nm，而D-LH2类似物(2c、2g和2h)的红光波长超过600 nm。b) Fluc与底物类似物在pH 8.0时的相对kcat。2g的相对kcat高2.3倍，2h的相对kcat低2倍。c) Fluc与天然D-LH2 (2a)和新型甲基D-LH2类似物2g和2h的动力学参数比较。d) ph依赖性的Fluc在2h时的生物发光强度。天然D-LH2 2a的最适pH值为pH 8.0，而2d、2g和2h的最适pH值分别为pH 7.5、7.0和8.0。2b和2c在pH为6.5和6.0时表现出弱酸性，而2e在pH为9.0时表现出最强的活性。

图5：利用LUMOS技术检测各种样品(缓冲液、血清和尿液)中有机磷农药及其代谢物。

图6：用荧光闪烁仪测定苹果、香蕉和番石榴等水果中有机磷农药的浓度。

图6。用荧光闪烁仪测定苹果、香蕉和番石榴等水果中有机磷农药的浓度。a) LUMOS检测程序包括3个简单的提取步骤(方案一);生物降解-荧光素合成(溶液II)和生物检测(溶液III)。在100 mM HEPES-NaOH pH 8.0的溶液(溶液I)中，用10% (v/v)的甲醇提取被OPs污染的水果(3a-3e)，并对提取的样品进行荧光闪烁(LUMOS)和高效液相色谱(HPLC/MS)分析比较。对于LUMOS检测，向样品中加入生物降解酶混合物，孵育30-60分钟，使农药完全降解，并形成D-LH2及其类似物(2a、2e和2g)。然后加入Fluc鸡尾酒溶液，用光度计立即测量相对光单位(RLU)。b) HPLC/MS与LUMOS检测灵敏度比较。HPLC/MS的检出限(LOD)在ppb- ppm之间，LUMOS的检出限(LOD)在ppt之间，低于规定的OPs污染水平(以苹果为代表)。每个OPs (3a - 3e)的MRL水平为10 ppb (3a除外为50 ppb)。c)用0.1 ppm OPs污染的苹果进行LUMOS反应的照片。d) LUMOS与0.1 ppm有机磷农药污染香蕉的反应。e) LUMOS与0.1 ppm OPs污染的番石榴反应。

【总结】

本研究工作建立了以酚类化合物(为原料，利用稳定的HadA和相关酶促反应(HELP反应)从头合成荧光素酶(D-LH2)类似物的方法。该方法功能强大，成功合成出两个全新的D-LH2类似物，合成8个D-LH2衍生物，且产率良好(51%)。与天然的D-LH2相比，新化合物具有更亮、更稳定的光波长和更长的光波长。生物催化HELP反应简单、环保，并具有可扩展性。更重要的是，本研究工作开发一种基于HELP酶促反应的LUMOS检测技术方法，可以不经任何前处理原位检测食品、蔬菜和水果等表面的有机磷农药残留，检出水平达到ppt水平。

【文章信息】

P. Watthaisong, P. Kamutira, C. Kesornpun, et. al., Angew. Chem. Int. Ed. 2022, e202116908;

https://doi.org/10.1002/anie.202116908

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