文章来源： 中华结核和呼吸杂志,2020,43(08) : 688-691

DOI：10.3760/cma.j.cn112147-20190926-00649

作者：高玉洁 李俊明

单位：南昌大学第一附属医院

摘要

结核病的蛋白质组学研究是当前的热点，蛋白质组学分析在寻找新的结核病诊断标志物、筛选药物靶点、评估新疫苗及了解疾病发生机制方面具有广阔的前景。本文旨在综述蛋白质组学在结核病诊断标志物筛选中的研究进展，重点介绍蛋白质组学策略及蛋白质组学技术在活动性结核病、结核分枝杆菌潜伏感染、耐药结核病和儿童结核病诊断标志物筛选中的作用，探讨生物标志物转化在临床应用方面的潜力和挑战。

结核病是由MTB感染引起的慢性感染性疾病，是全球十大死亡原因之一。2019年世界卫生组织（WHO）报告显示约有1 000万人患结核病，120万例死亡[1]。快速而准确的诊断是控制结核病的关键环节之一。目前，结核病的诊断主要根据临床表现、影像学检查和实验室检查。由于影像学检查的敏感度和特异度均不是很理想，而结核病的临床表现又多种多样，很多患者症状不典型，因此实验室检查是目前结核诊断的主要依据。但目前，结核病诊断的实验室检测方法均存在不同程度的敏感性差、检测周期长和操作复杂等问题，难以满足临床要求，因此，筛选新的结核病诊断标志物以促进结核病的快速、准确诊断对全球结核病的控制至关重要。蛋白质组学技术是筛选疾病诊断标志物的经典方法，随着蛋白质组学相关技术的发展和对结核病认识的加深，近年来蛋白质组学技术在结核病诊断标志物的筛选和鉴定方面获得了广泛应用。现将近年来蛋白质组学技术在结核病诊断标志物筛选中的应用及其研究进展综述如下。

一、蛋白质组学技术及其分析策略

1991年Nagai等[2]首次应用双向电泳（2-DE）结合质谱技术分离和鉴定了MTB H37Rv菌株早期培养滤液中的蛋白质，拉开了MTB蛋白质组学研究的序幕。最初，研究者多采用双向凝胶电泳等凝胶技术分离蛋白质[3]。双向电泳技术具有较高的分辨率和良好的重现性，但对极酸性或碱性、疏水性和低丰度蛋白的分离能力差，因此在对含大量高丰度蛋白的血清等体液标本进行生物标志物的筛选和鉴定时存在一定的限制。近年来，无标记定量和稳定同位素标记技术等非电泳分离技术的发展极大地推动了蛋白质组学技术的发展，并在结核病生物标志物的筛选和鉴定中得到了大量的应用。.

无标记定量技术或非标记定量技术（label-free）是一种通过直接分析在蛋白质鉴定时所产生的质谱数据，比较来自不同样品的相应肽段的信号强度而进行蛋白质相对定量的方法。与双向电泳技术比较,无标记定量技术更省时省力，且因无需进行复杂的标记，无标记定量方法具有样品制备简单、数据分析便捷等优点，适合大样本的差异蛋白筛选。稳定同位素标记技术中最常用的是iTRAQ技术，是一种体外同位素标记的相对与绝对定量技术,其利用多种同位素标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团,再利用高精度质谱仪串联分析,可同时比较多达8组样品之间的蛋白表达量,具有定量精确、高效率样品分离、高鉴定率、适用范围广等优点[4]。

蛋白质组学筛选疾病标志物的常规策略是先进行组学筛查，然后用ELISA或免疫印迹技术验证差异蛋白的表达，再通过盲测法进行临床效能的验证[5,6,7]。随着蛋白质组学技术的不断发展，基于靶向蛋白质组学的\"三角策略\"逐渐开始应用于生物标志物的筛选和验证[8]。靶向蛋白质组学是一种基于候选蛋白质的蛋白质组学技术,可能够根据肽的质量和（或）裂解特点,通过多重反应监测技术、平行反应监测技术或数据非依赖采集技术在复杂的背景中检测出代表目标蛋白质的特定肽[9]，实现对目标蛋白或肽段的准确定量，具有很好的抗干扰能力且敏感度较高，常用于初筛得到的目标蛋白表达水平的验证。在此基础上建立的\"三角策略\"包括发现、验证和再确证，即首先用鸟枪蛋白组学（shotgun proteomics）在相对较小样本量中识别差异表达蛋白作为候选蛋白质组，然后在中等样本量中用靶向蛋白质组学对候选蛋白质组进行验证，最后用免疫分析方法在大样本中对非常有希望的蛋白质进行评估以验证其临床相关性[10]。靶向蛋白质组学技术与ELISA和免疫印迹等传统验证技术相比能检测到的蛋白范围更广，对低丰度蛋白更敏感，且由于分析过程无需借助特异性抗体，靶向蛋白质组学技术的成本更低，更省时省力，尤其对于尚无商品化抗体的蛋白质的验证是最佳选择之一。

二、蛋白质组学技术在活动性结核病诊断中的应用

活动性结核的诊断是临床最为关注的问题。处于活动期的结核病患者，体内MTB的代谢和人体的免疫应答均很活跃，MTB分泌的蛋白和人体组织细胞表达的蛋白种类和水平都会发生改变，部分蛋白可能释放至局部组织、体液甚至进入血流，这些表达改变的蛋白即可作为结核病诊断的标志物。由于具有标本获取方便、微创、操作简便等优点，以血清或血浆为标本的体外诊断方法一直是最受欢迎的方法。Zhang等[11]应用表面增强激光解吸或电离飞行时间质谱（SELDI-TOF MS）技术结合芯片技术，筛选出了50个在结核病组与对照组间存在显著差异的蛋白峰，并选取了其中3个蛋白峰进行系统分类，建立诊断模型，结果显示该3个蛋白联合诊断模型对活动性结核病诊断的敏感度为96.9%，特异度为97.8%，该学者采用液相色谱串联质谱技术鉴定了其中一种差异最大的蛋白质峰，显示其为α-酸性糖蛋白。在此基础上，作者通过免疫印迹技术证实了该蛋白在结核病患者血清中高表达，其水平显著高于健康对照组和非结核病的疾病对照组，提示这种蛋白是一种非常有潜力的结核病诊断标志物。Li等[5]采用iTRAQ技术结合基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术对活动性肺结核和对照组（肺炎、健康人）血清的差异蛋白进行了筛选，发现了26个显著差异表达的蛋白，结合生物信息学分析，并通过免疫组织化学和免疫印迹技术的验证，作者发现其中一种蛋白，即性激素结合球蛋白（SHBG）具有潜在的诊断价值。在此基础上，作者通过ELISA方法在另一组独立样本中进行了盲测验证，结果显示该蛋白诊断肺结核的敏感度和特异度分别为75.6%和91.5%。

以血清或血浆为研究标本，其他一些研究团队[6,12,13,14]应用iTRAQ或label-free技术及SOMAscan技术也陆续筛选得到了一系列具有活动性结核病潜在诊断价值的差异表达蛋白，显示蛋白质组学技术在结核病血清或血浆生物标志物的筛选中正得到越来越多的关注。除此之外，蛋白质组学技术也被应用于从人体其他体液标本中筛选结核病的诊断标志物。如Wang等[7]采用二维电泳结合MALDI-TOF-MS技术分析了45例初诊肺结核患者和45例健康对照患者的尿液蛋白组学特征，鉴定出了19种差异表达蛋白，并通过Western blotting和qRT-PCR技术在独立样本中分别验证了这些蛋白的翻译和转录水平，结果发现甘露糖结合凝集素2和α-胰蛋白酶抑制剂H4的差异表达最显著，这2个蛋白联合miR-625-3p水平诊断结核病的敏感度为85.87%，特异度为87.50%。

除了尿液标本外，研究者们采用蛋白质组学技术从脑脊液、胸腔积液和腹水等体液标本中同样筛选到了一些结核病诊断的潜在标志物。如Mu等[15]采用iTRAQ™技术结合LC-MS/MS技术发现载脂蛋白B可用于区分结核性脑膜炎患者与健康对照和病毒性脑膜炎患者，其敏感度和特异度分别达到89.3%和92.0%。Shi等[16]应用iTRAQ TM结合LC-MS/MS技术对结核性胸腔积液和恶性胸腔积液的差异蛋白进行了筛选，发现纤连蛋白、组织蛋白酶G和白三烯-A4水解酶具有潜在的诊断价值，且其组合在区分结核性胸腔积液和恶性胸腔积液时有较高的诊断能力。此外，还报道了利用蛋白质组学技术在体液标本中筛选结核病诊断标志物的研究成果[17,18,19]，提示蛋白质组学技术在结核病诊断标志物的筛选中正发挥着越来越重要的作用。

三、蛋白质组学技术在MTB潜伏感染人群筛查中的应用

研究结果显示，绝大多数的结核病来自MTB潜伏感染的活化，因此MTB的潜伏感染者是结核病的主要来源。WHO的报告显示，MTB潜伏感染人群约17亿[1]。一般情况下，这些潜伏感染者中5%~10%的人最终发展为活动性结核病，但对于免疫功能低下人群，如并发HIV感染、接受激素或免疫抑制剂治疗的感染者，结核病活化的概率大大提高，因此准确鉴别出这一人群并有针对性地加以干预，对于预防MTB的活化具有积极意义。

MTB潜伏感染者机体内长期带菌，可能会诱导抗体产生免疫防御反应，导致相关蛋白的表达发生变化，这些变化的人体应答蛋白和MTB释放的蛋白可作为诊断和鉴别诊断的潜在生物标志物。如通过采用弱阳离子交换磁珠分馏联合MALDI-TOF MS技术对MTB潜伏感染者和健康人的差异血浆蛋白进行筛选，发现了5个差异性蛋白峰，随后采用纳米液相色谱-离子喷雾-串联质谱联用技术从中成功鉴定了14个潜在的MTB潜伏感染的生物标志物，并通过免疫印迹技术对其中6种蛋白进行了验证[14]。Sun等[20]采用无标记蛋白质组学技术（label-free）对活动性肺结核和MTB潜伏感染者血浆中差异蛋白进行了筛选，发现了31个在肺结核、MTB潜伏感染和健康人群中具有显著表达差异的蛋白，通过Western blot和ELISA技术的验证，发现α-1-抗胰凝乳蛋白酶、α-1-酸性糖蛋白1和E-钙黏蛋白具有潜在的诊断价值，基于这3种蛋白建立的联合诊断模型显示，联合这3个指标可较好的区分肺结核患者和MTB潜伏感染者，其敏感度和特异度分别达到75.0%和96.1%。

四、蛋白质组学技术在耐药结核病生物标志物筛选中的应用

耐药结核病是当今世界非常严峻的公共卫生问题,直接影响着全球结核病疫情的控制。药敏试验是耐药结核病诊断的金标准，但常规的MTB药敏试验需要6~8周才能得到结果。因此，有研究者希望借助蛋白质组学技术筛选和鉴定与MTB耐药性相关的生物标志物，以作为耐药结核病的辅助诊断工具[21]。通过对耐药菌株的蛋白质组进行分析可发现一些耐药性的潜在标志物。Sharma等[22]应用二维凝胶电泳（2DGE）结合MALDI-TOF-MS技术对链霉素耐药及敏感菌株的分泌蛋白进行差异蛋白质组学分析，发现在耐药分离株中有15种分泌蛋白的表达水平显著上调，其中5种蛋白具有未知的功能，这些过表达蛋白的累积效应可能与链霉素耐药有关，可作为诊断标志物或潜在的药物靶点。de Keijzer等[23]先应用纳米气相色谱-质谱联用技术对分离自临床结核病患者的、较常出现耐药现象的MTB北京株和对结核病治疗药物敏感的MTB标准株H37Rv的蛋白质进行比较分析，然后通过数据依赖采集和靶向蛋白质组学方法，对其中存在差异表达的33个候选蛋白的丰度进行量化，结果显示在MTB北京株和标准株间确实存在表达显著差异的蛋白质，但由于作者并未对这些候选分子进行进一步的研究分析，其临床诊断效能尚需临床验证。此外，还有些学者[24,25,26]通过对MTB的耐多药菌株与敏感菌株进行比较蛋白质组学分析，在耐多药MTB中鉴定到了一些差异表达蛋白，这些蛋白可能成为有价值的结核病候选疫苗或耐药结核病快速诊断的标志物。

除了分析MTB来源的差异蛋白外，对不同MTB感染的宿主蛋白组的比较分析也是耐药结核病诊断研究的主要目标之一。我国学者Wang等[27]通过iTRAQ与测序技术的联合应用，在耐多药结核病患者血清中鉴定出了50个差异表达蛋白和43个差异表达miRNA，在分别采用ELISA技术和qRT-PCR技术进行验证后，作者建立了联合CD44、KNG1激肽原1、miR-4433b-5p、miR-424-5p和miR-199b-5p生物标志物的耐多药结核病诊断模型。作者认为这一整合的转录组学和蛋白质组学数据不仅发现了一组可能用于耐多药结核病诊断的miRNA或蛋白，而且对揭示耐多药结核病的分子发病机制具有重要意义。

五、问题与展望

近十年来，国内外很多研究者应用蛋白质组学技术开展了大量结核病诊断标志物的筛选研究，并取得了一定进展。但通过综合这些研究可以发现，蛋白质组学技术在结核病诊断标志物的筛选研究和应用中仍存在一些亟需解决的问题：（1）检测标准化较差：样品的采集标准、样品准备的一致性及操作流程不同均可导致研究结果的差异，如尿样在储存过程中经常不稳定，因此需要研究稳定尿蛋白的最佳方法。（2）敏感度不够：样本预处理需去除高丰度蛋白，这将面临着低丰度蛋白质损失严重、疏水性膜蛋白质溶解困难等问题,进而影响蛋白质检测的敏感度。（3）生物标志物的验证是蛋白质组学研究成果应用于临床的重要一环。质谱技术筛选出的差异表达蛋白往往较多，可能是几十种甚至上百种，因此需要在验证的标准化和验证程序方面进行不断的改进，以提高蛋白质生物标志物的重现性和准确性。

然而，尽管在生物标志物的发现过程中目前仍存在一些技术障碍，但蛋白质组学相关的理论和技术均在不断地快速发展，蛋白质组学检测和分析手段、敏感度和重现性均有了质的飞跃，相信在不久的将来人们将可以实现更深入的蛋白质组学检测和PTM翻译后修饰分析。也许未来可能通过不同蛋白质组学技术的结合互补，或蛋白质组学技术与其他新兴技术的综合应用，实现为结核病建立一个有效和可靠的生物标志物的目标。

参考文献略