Abstract背景:

人类感染动物源跨种传播的冠状病毒( Coronavirus，CoVs)，包括严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，引起全球的极大关注.本文报道了一种可导致人严重、甚至致命肺炎的新型冠状病毒.

方法:

收集湖北省武汉市金银潭医院5例重症肺炎患者的临床资料和支气管肺泡灌洗(BAL)样品.提取BAL的核酸进行了下一代测序分析，对样本开展病毒分离，序列使用最大似然估计法构建系统发育进化树.

结果:

5例患者在2019年12月18日至12月29日间入院，患者均有发热、咳嗽、呼吸困难，并发急性呼吸窘迫综合征.胸部放射性检查显示肺部弥漫性毛玻璃样病变和实变.一例患者死亡.宏基因组深度测序结果显示，从5例患者BAL样本中均发现一个以前未知的β属CoV毒株序列，毒株之间的核苷酸序列相似度为99.8%-99.9%.这些毒株与SARS-CoV (GenBank NC_004718)核苷酸序列的相似度为79.0%，与MERS-CoV (GenBank NC_019843)的相似度为51.8%.该病毒与蝙蝠来源的SARS样冠状病毒(SL-ZC45，GenBank MG772933)亲缘关系最接近，核苷酸序列相似度为87.6~87.7%，但在进化上属于一个单独的分支.新型病毒毒株都包括一个完整的开放阅读框基因8，提示新病毒可能起源于蝙蝠.然而，推测的受体结合域的氨基酸序列与SARS-CoV相似，说明这些病毒可能使用相同的受体.

结论:

本研究鉴定了一种可导致人类严重和致死性呼吸道疾病的新型冠状病毒，可能起源于蝙蝠.

冠状病毒(Coronavirus，CoVs)是基因组为单股正链RNA (长度约26-32 kb)的有包膜病毒.属于冠状病毒科(Coronaviridae)正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae) ，亚科包括四个属: Alphacoronavirus (α)、Betacoronavirus(β)、Gammacoronavirus (γ)和Deltacoronavirus (δ)[1,2]病毒基因组通常编码四种结构蛋白:刺突蛋白(Spike，S)、包膜蛋白(Envelope，E)、基质蛋白(Membrane，M)和核衣壳蛋白(nucleocapsid ,N)，以及几种非结构蛋白和多种独特的辅助蛋白. [1,2]

CoVs可以感染人类及多种鸟类和哺乳类动物.目前已知有六种CoVs可以感染人类，包括两种α属的(229E和NL63)、四种β属(OC43，HKU1，严重急性呼吸系统综合症[severe acute respiratory syndrome，SARS]-CoV和中东呼吸综合征[Middle East respiratory syndrome，MERS]-CoV)的成员. [1,2,3,4]人类CoVs共有的一个显著特征是它们都是动物源跨种来源.特别要指出的是，[5]蝙蝠被认为是CoVs的主要宿主，许多人类CoVs都被认为是来源于蝙蝠[5,6].自本世纪初以来，已发现了两种可以导致人体严重疾病的动物源跨种传播CoVs，即SARS-CoV和MERS-CoV. [3,4,7]2003年SARS-CoV的爆发导致了全世界出现8,096例病例和794例死亡病例. [8]2012年在中东地区发现的MERS-CoV，已感染了2,260人，目前的病死率为35.5%. [9,10]这些传染病的暴发引起了全球对其它潜在新型动物源跨种传播CoV的担忧.

本研究报道从5例中国武汉不明原因肺炎病例中鉴定的可引起严重和致死性肺炎的新型CoV.序列分析结果表明，该病毒含有一个开放阅读框基因8 (ORF8)，与蝙蝠SARS样CoV的亲缘关系最密切，但其属于一个单独的进化分支.新发现冠状病毒推测的受体结合域(receptor binding domain，RBD)的氨基酸序列与SARS-CoV相似，提示它们可能使用相同的受体.研究发现强调常态化监测可能跨种传播到人类的蝙蝠源CoV的迫切需求.

方法伦理审查

本研究按照《赫尔辛基宣言》设计实施，通过中华人民共和国国家卫生健康委员会和武汉金银潭医院伦理委员会批准(编号KY-2020-01.01) .鉴于研究对象为新发传染病，免除对书面知情同意的要求.

临床样本和数据收集

收集2019年12月18至29日之间武汉金银潭医院5例肺炎患者支气管肺泡灌洗液(BAL).收集的资料包括临床数据、人口学特征、基础性疾病情况、临床症状和体征、胸片检查结果、临床实验室检测结果、旅行史、近期动物接触史以及临床转归结局.收集的数据信息属于中华人民共和国国家卫生健康委员会确定的公共卫生暴发调查的内容.

基因组测序

从每例病例中各取200 μl BAL提取核酸，提取试验在生物安全防护三级实验室中进行.提取方法是采用Direct-zol RNA Miniprep试剂盒(Zymo Research，Irvine，CA，美国)和Trizol LS (ThermoFisher Science，Carlsbad，美国)试剂.核酸洗脱体积为50-µl.使用Qubit荧光计(Thermo Fisher Scientific，Carlsbad，CA，美国)测定DNA/RNA浓度.测序文库使用转座酶的方法构建，在Illumina测序平台(Illumina，San Diego，CA，美国)上进行测序.在Illumina NextSeq平台上，采用76 bp单端测序，每个样本至少生成了2,500万个测序片段数目.质量控制过程包括通过bbduk去除低复杂度数据(熵= 0.7，entropy-window = 50，entropy k = 5;版本: 2019年1月25日)，[11]，用Trimmonatic去除接头，清除低质量数据和短读长数据(接头: TruSeq3-SE.fa:2:30:6，LEADING: 3，TRAILING: 3，SLIDING WINDOW: 4:10，MINLEN: 70,版本: 0.36) ，[12]用bmtagger方法去除宿主信息(使用人类基因组GRCh38和yh-特定序列作为参考序列) [13]，去除核糖体RNA (SortMeRNA，版本: 2.1b) . [14]使用Kraken 2将质控后数据根据参比数据库(包括古菌、细菌、真菌、人、质粒、原生动物、载体和病毒序列)进行注释(软件版本: 2.0.7-β，数据库版本: 2019年8月2日) . [15]每一轮测序均设置阴性对照排除体系污染.在去除接头和人类数据之后，将剩余数据比对到微生物基因组数据库(包括病毒、细菌、真菌和寄生虫)中进行注释.病毒基因组序列通过特异性引物和一步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)进行sanger测序验证. .

系统发育分析

使用MEGA软件(版本: 7.0.14)的ClustalW方法进行多序列比对.用MEGA软件(版本: 7.0.14)的最大似然估计法构建系统发育进化树.病毒的全基因组序列收录在流感数据的全球计划数据库(GISAISD，No. EPI_ISL_402123，EPI_ISL_403928-31)和中国科学院北京基因组研究所(BIG)国家基因组科学数据中心(项目编号PRJCA002165;自2020年1月起在https://bigd.big.ac.cn/gwh公开访问) .

病毒分离

BAL样本接种于Vero细胞(ATCC，CCL-81).每天观察所有培养物的细胞病变效应(CPE).于第4天更换含有终浓度为1 μg/mL的对苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)酶的维持培养基，接种后第7天终止培养.将出现CPE的细胞培养上清用多聚甲醛灭活处理，用覆盖碳膜的铜网吸附干燥后用1%磷钨酸溶液(pH7.0)对病毒颗粒进行负染，并用120 kV TECNAI (Thermo Fisher Science，Hillsboro，OR，美国)电子显微镜观察，用Gatan832 (Gatan，Pleasanton，CA，美国)拍摄记录病毒颗粒形态.用特异性引物通过RT-PCR扩增病毒核酸进行测序验证[见附件引物序列信息表1].

表1:

患者的人口学、流行病学、临床表现和治疗信息.

免疫荧光检测

将20 µl病毒感染或未感染的细胞悬液涂于12孔聚四氟乙烯包被的玻片上，以制备小孔片.将细胞用4%的多聚甲醛在1×磷酸盐缓冲液(PBS)中固定30 min，用pH值7.4的PBS洗3次，用1%BSA封闭，用1:200稀释的恢复期患者血清或健康人血清37°C孵育细胞30 min，用结合异硫氰酸荧光素(flourescein isothiocyanate，FITC)的羊抗人免疫球蛋白G (Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.，West Grove，PA，USA—)作为二抗进行标记染色.细胞核和细胞质分别用4′,6′-二氨基-2-苯环吲哚(DAPI)和伊文思蓝(Evans blue，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，美国)进行复染.用激光扫描共聚焦显微镜(AiryscanLSM 880，Zeiss，德国柏林)观察记录荧光图像.

结果病例一般信息

病例1是一位65岁的男性，因高热、咳嗽，少痰就诊.他持续发热，并在症状出现后的16天后出现严重的气短症状.他是中国湖北省武汉市华南海鲜市场的工作人员.病例2是一位49岁的女性，初始症状表现为高热和干咳，5天后开始呼吸困难，入院治疗.她也是华南海鲜市场的一名工作人员.病例3是一位52岁的女性，没有证据表明其与华南海鲜市场有接触史.她因发热、咳嗽和胸部CT扫描中肺部的磨玻璃状阴影而住院.病例4是一名41岁的男性，起病表现为高热和干咳，7天后进展为急性呼吸窘迫综合征.这位患者没有华南海鲜市场暴露史.病例5是一名61岁的男性，因连续7天的发热、咳嗽和呼吸困难而入院，他在该海鲜市场工作.

在既往史方面，病例4患有高血压，病例5患有慢性肝病和腹部粘液瘤，而其他患者均未记录有基础性疾病. 表1概述了这五例病例的人口学和临床特征.

新型CoV的下一代测序

质控后测序数据占原始数据的12.0-92.0%.大多数测序数据都可以比对到参比基因组上.值得注意的是，患者5的样本中80.3%的测序数据可被注释到病毒基因组中，所占比例最高.几乎所有病毒基因数据(97%)都可注释到冠状病毒科(Coronaviridae).在其他四个病例中，通过拼接和校正，大部分注释的病毒基因数据至β-CoV，并得到了该CoV的共有序列.

大部分测序数据可以注释到(BWA mem，版本: 0.7.12)新发现的CoV基因组，其可注释的比例从患者4中的71,883条(0.27%)到患者5的37,247,818条(85%)短读长数据不等.此外，极少数的测序数据可匹配至已知的细菌等病原微生物，包括链球菌、鲍曼不动杆菌和假单胞菌[图1A,图1B,图1C,图1D,图1E].

图1:

基于下一代测序对患者1(A)、患者2(B)、患者3(C)、患者4(D)和患者5(E)的支气管肺泡灌洗液样本中微生物种类分布(比例)的分析.

将匹配至CoVs的数据进行拼接后，获得的基因组序列通过Sanger测序进行验证.从5个病例中获得的5个全基因组序列，其核苷酸(nt)相似度为99.8%~99.9%.获得的基因组全长为29,870 bp，GC含量为37.99~38.02%.基因组组成为5'-ORF1ab-S-E-M-N-3’，与已知的SARS样(SL) CoV相似[图2A].此外，还发现了Sarbecvirus亚属中独特的辅助性开放阅读框架(UA-ORFs) ，位于结构蛋白之间，5'端至3’端分别编码ORF3、ORF6、ORF7和ORF8蛋白(图2A).

图2:

病毒基因的特征. (A)新型冠状病毒(CoV)基因组结构示意图. (B)病毒全基因组、(C)刺突蛋白、(D)核衣壳蛋白和(E)RNA依赖的RNA聚合酶基因的进化树.新型CoV病毒和与其亲缘关系较近的病毒在进化树中以红色标出.来自公共数据库的其他外部病毒序列以蓝色显示.用最大似然法计算进化距离. (F)基于IPBCAMS-WH-01/2019参考毒株推测的受体结合区(RBD)氨基酸序列与SARS冠状病毒(SARS-CoV)和蝙蝠SARS样冠状病毒序列的比较.

进化分析

同源性分析表明，病毒的全基因组序列与既往报道的SARS-CoV Tor2 (GenBank NC_004718)、MERS-CoV (GenBank NC_019843)以及从中国菊头蝠中分离得到的蝙蝠SL-CoV ZC45和ZXC21 (GenBank MG772933，MG772934)的同源性分别为79.0%、51.8%和87.6%~87.7%[表2]，提示新型CoVs与蝙蝠SL-CoVs最相近.

表2:

以IPBCAMS-WH-01/2019毒株序列为参考推测的蛋白定位和大小.

与蝙蝠SL-CoV ZC45相比，新发现CoV的S、E、M和N基因的同源性分别为75.9%、98.6%、93.2%~93.4%和91.1%. ORF1ab与蝙蝠SL-CoV ZC45的核苷酸同源性为89.0%.而在不同CoVs间最保守的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)序列[1,4]与蝙蝠SL-CoV ZC45仅有86.3%~86.5%的核苷酸序列同源性.根据国际病毒分类学委员会的标准，如果保守的RdRp序列的核苷酸同源性小于90%，可作为定义CoV新种的参考依据[4].因此，我们认为新发现的CoVs可被归类为Betacoronavirus属Sarbecovirus亚属的新种.

用RdRp、S、N基因序列和全基因组构建最大似然模型系统发育进化树，新CoVs毒株序列均与蝙蝠SL-CoVS ZXC21和ZC45密切相关，但是这5株序列位于Sarbecvirus亚属下的一个单独的进化分支[图2B,图2C,图2D,图2E]，这与同源性分析结果一致.

新型CoVs中存在ORF3和完整的ORF8基因区，这是蝙蝠源CoVs的特征[17,18].新型CoVs的ORF3与蝙蝠SL-CoV ZC45的核苷酸及氨基酸同源性分别为87.8%和90.9%，但与Sarbecovirus亚属的其他成员之间同源性分别低于76.8%和76.0%.另外，新型CoVs的ORF8与蝙蝠SL-CoV ZC45的核苷酸及氨基酸同源性分别为88.5%和94.2%，与Sarbecovirus亚属的其他成员的同源性分别低于67.8%和58.6%.这些发现进一步表明，新型CoVs来源于蝙蝠.

CoV S蛋白中的RBD决定了宿主的嗜性[19].新型CoV的RBD氨基酸序列具有多种特征，包括与不使用人血管紧张素转换酶2 (human angiotensin-converting enzyme，hACE2)的SL-CoVs (61.5–64.1%)相比，其与SARS-CoV (73.8-74.8%)和使用hACE2的SL-CoVs (76.4-76.9%)具有较高的同源性.该新型CoV的RBD区域并不具有不使用hACE2为受体的蝙蝠来源SLCoV RBD中常见的缺失[图2F][20].此外，SARS-CoV RBD中与hACE2相互作用的5个关键氨基酸残基(Y442，L472，N479，D480，T487)与新型CoV中的相应残基(L，F，Q，S，N)虽然不同，但他们之间具有相似的氨基酸极性特征[20,21].这些结果提示新型的CoV仍是使用hACE2作为受体.

病毒培养

两次传代后，30%的Vero细胞接种新型CoV后观察到了CPE[图3A].这些细胞呈圆形、屈光性和合胞状.用负染色电镜进一步观察了CPE作用下的Vero细胞，显示出具有特征性的CoV颗粒特点[图3B].将出现CPE的Vero细胞固定后，加入恢复期患者血清进行免疫荧光检测，显示细胞胞浆中呈阳性绿色荧光信号，而加入对照血清组未检测到任何信号，表明细胞中存在病毒颗粒[图3C].

图3:

病毒分离和鉴定. (A)用倒置显微镜观察对照组(左)和Vero细胞中的病变效应(右) (原放大倍数×20). (B)用1%磷钨酸溶液对病毒颗粒进行负染色，用电镜观察(标尺200 nm). (C)用恢复期患者血清和结合FITC的羊抗人IgG免疫荧光检测结果，Vero细胞胞浆中的阳性信号(绿色)，细胞核和细胞质分别用4′,6′-二氨基-2-苯环吲哚(DAPI，蓝色)和伊文思蓝(红色)进行复染(标尺20 μm).

患者的临床特点及结果

表2总结了5例患者的临床特点和实验室检查结果.发热、咳嗽和呼吸困难是最常见的症状.这些患者的白细胞计数各不相同，但淋巴细胞计数普遍较低.丙氨酸转氨酶和血清肌酸水平正常或略有升高. 图4为其中2个病例胸部影像学检查的结果，图4A和图4B分别为病例2症状出现后第10天主动脉弓扫描和肺静脉扫描层结果，图4C和图4D分别是病例5发病后第12天和第13天检查结果，可见到双侧磨玻璃影和实变.

图4:

胸部影像学检查.患者2的胸部断层扫描结果，发病后第10天从(A)主动脉弓和(B)肺静脉的扫描层结果，显示双侧磨玻璃阴影和实变;患者5在发病后第12天(C)和第13(D)天结果，显示为白肺.

在这些病人中还观察到了一些并发症. 5例患者中有4例(除患者3外)出现了急性呼吸窘迫综合征且需要氧疗，2例患者进行了体外膜肺氧合.两名患者(患者1和5)发生了继发性感染，患者5继发败血性休克和急性肾损伤，并最终死于多器官功能衰竭.患者3于2020年1月8日(症状出现后第17天)出院.另外三名患者在撰写本稿件时仍在住院.这些病人的治疗情况见表1.

讨论

在本研究中，我们从重症肺炎患者呼吸道样本中发现了一种以前未知的CoV.用下一代测序方法从5例病例中获得了病毒的全基因组序列，在BAL样本中注释到CoV的测序数据在所有病毒数据中占比最高. 5个CoV的全基因组核苷酸的同源性达到99.8~99.9%.从病例样本中成功分离出的病毒也能被患者恢复期的血清识别.这些结果表明新发现CoV与这些患者的肺炎发生有关.然而，这种新型CoV能否在实验动物中引起类似的症状仍有待研究.

病毒基因组序列同源性分析表明，新发现CoV与已知的人CoVs不同.其同源性最近的病毒是2005年在距武汉地理位置较远的浙江舟山发现的来自菊头蝠的SL-CoVs (GenBank编号MG772933、772934)[22];然而，它们之间全基因组核苷酸同源性仅为85.7%~86.8%.进化分析表明，该病毒毒株形成独立的分支.综上，该CoV应被归类为为一个新种. 2003年非典的暴发极大地提高了对突发CoVs威胁的认识.因此，人们在监测新出现的新型CoV并追踪其起源方面作出了巨大努力，为人间潜在的传染病大流行建立风险评估和预警体系.阐明动物，尤其是作为各种CoVs"病毒库"的蝙蝠中冠状病毒组特征，应是当前所有工作的重中之重[23,24].

这些新型CoVs有几个显著的特点表明它们来源于蝙蝠.首先，新型CoV的基因组序列与蝙蝠SL-CoV ZC45的基因组序列有高度的的相似性.其次，系统发育分析表明，这些病毒在进化上接近蝙蝠SL-CoVS ZXC21和ZC45.第三，所有这些新型CoVs都含有ORF3和完整的ORF8基因域，这是蝙蝠源CoVs的特征[17,20].此外，新型CoVs的N端结构域(N-terminal domains，NTDs)的氨基酸序列与ZC45和ZXC21非常相似，但RBD序列与SARS-CoV的氨基酸序列同源性高于ZC45和ZXC21，提示S基因的NTD和RBD之间可能发生了重组事件，从而促进了物种间的传播.

由于目前疾病流行信息的缺乏，新型CoV的传播模式仍不明确.值得注意的是，5名患者中有4人最近曾接触过武汉的一个海鲜市场.然而，在撰写本稿件时，传染源尚不清楚.据推测，跨种传播动物源CoV多是通过中间宿主感染人类的;例如，骆驼被认为是MERS-CoV的中间宿主，而果子狸则可能促成了SARS-CoV向人类的跨物种[25,26].蝙蝠CoV可能在哺乳动物宿主间的传播过程中，通过进化适应人类，进而能够有效地感染人类[26].然而，两个病例没有接触该海鲜市场的经历.因此，需要进一步调查研究，以确定导致这一疫情可能存在的多个传染源头.

新型CoV最突出也是最令人担忧的特征之一是它能够引起严重的呼吸综合征，疾病进展迅速，主要表现为下呼吸道感染特征，没有明显的上呼吸道症状，如咽喉痛和流鼻涕鼻.因此，需要对病毒受体在器官中的分布进行进一步的探讨，以阐明其致病机制.此外，还应该明确轻度感染或亚临床感染的疾病表型，明确这种疾病表型对于控制疾病的传播至关重要.建立血清学分析方法将大大有助于从群体水平上鉴别这类感染.

总的来说，我们发现了一种新的蝙蝠源CoV，与人类严重和致死性的呼吸道疾病有关.这种病毒的突发给公众健康带来巨大威胁.因此，迫切需要阐明感染的来源和传播方式以控制传染病的流行.

志 谢

我们感谢Wang Chen博士、Zhao Zhendong博士、Guo Fei博士(中国医学科学院，北京协和医学院)和Li Mingkun博士(中国科学院北京基因组研究所)对稿件的审阅和讨论.我们还感谢为样品收集和实验做出贡献的同事.

利益冲突

利益冲突　无.

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