引用本文:

张琪, 李健, 沈琳. 如何解读NGS报告——一例进行两次NGS检测的肝内胆管细胞癌病案分享[J]. 肿瘤综合治疗电子杂志, 2019, 5(4): 72-78.

张琪，李健，沈琳（北京大学肿瘤医院 消化肿瘤内科 恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京 100142）

【摘要】 二代测序（next-generation sequencing，NGS）技术的发展和临床应用推动了肿瘤领域精准治疗前进，肿瘤突变负荷、微卫星状态、可靶向基因对肿瘤治疗预测和预后都发挥着重要作用。作为一种新的临床检测手段，各平台检测尚缺乏统一的标准，除尽快完善检测标准外，也要求临床肿瘤医生提高对NGS报告的解读能力。本文报道了一例进行两次NGS检测的肝内胆管细胞癌病例，从临床医生和测序平台角度解读两份报告，旨在探索临床肿瘤医生如何更好利用NGS检测、解读NGS报告。

【关键词】 二代测序；基因检测；肝内胆管细胞癌

肝内胆管细胞癌（intrahepatic cholangioc­arcin­oma，IHCC）是发病率仅次于肝细胞癌的原发性肝脏恶性肿瘤[1]，由于其早期诊断率低、恶性程度高，接近70%患者在诊断时已为不可切除或远处转移，即使根治性切除术后的患者复发率也极高[2]，术后辅助化疗的方案和获益目前仍存在争议[3,4]。AJCC分期Ⅲ期患者5年生存率仅为10%，Ⅳ期几乎为0%[5, 6]。近年来，随着精准治疗的推动，靶向药物在肺癌、结直肠癌、黑色素瘤等多个瘤种得到充分应用，并提高了生存期；此外，免疫治疗也在各个瘤种中“大放光彩”。而针对化疗药物不敏感的肝内胆管细胞癌，靶向治疗和免疫治疗是有望改善其预后的全身治疗方式。

肿瘤领域精准治疗的推动得益于二代测序（next-generation sequencing，NGS）技术的发展，包括目标靶向测序（targeted-regions sequencing，TRS）、全外显子组测序（whole-exome sequencing，WES）、全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS），短时间、低成本、高通量的优势使其与临床不断深入结合。但NGS作为一种新的临床检测手段，相较传统检测技术，其复杂程度大大提高，影响结果的不确定因素显著增多，实验操作和生物信息学分析方面不同平台及产品的标准不同导致在数据解读上面临许多挑战。临床医生如何能准确、充分地利用好这把利剑，是一个亟需解决的问题。因此，笔者报道了一例在全身治疗前分别送检两家公司进行NGS检测的肝内胆管细胞癌患者，并从临床医生和测序公司角度解读两份报告，旨在探索肿瘤临床医生如何更好地利用NGS检测、解读NGS报告。

1 病例简介

患者男，56岁，体检时超声发现肝占位。既往乙肝病毒感染20年，经干扰素治疗后HBsAg转阴。体格检查未见异常。癌胚抗原、甲胎蛋白等肿瘤标志物无异常。上腹部MRI示：肝S4/8段一类圆形肿块（图1红色箭头），下腔静脉旁淋巴结增大（图1红色圆圈部分）；进一步查PET/CT示：肝右叶多发低密度灶伴代谢增高，下腔静脉旁淋巴结增大未见代谢，余肺、消化道等部位未见恶性占位。患者于2018年11月26日外院行肝S4、5、8联合部分大网膜切除＋肝门淋巴结清扫术。术后病理显示肿物为肝内胆管低分化癌，清扫12、13组淋巴结无转移，无神经侵犯，切缘干净，分期：pT3N0M0（AJCC分期Ⅲ期）；免疫组化示：PD-L1肿瘤细胞＋（＞25%），HER2（＋＋）（FISH提示HER2/CSP＝1.24），pMMR。术后1周复查上腹部增强CT：肝切除术后，肝切缘旁可见片状低密度灶，多发索条影。后患者就诊本科，结合患者局部分期较晚，PD-L1表达较高，经患者同意后，予帕博利珠单抗（200 mg q21d）、奥沙利铂和替吉奥（奥沙利铂 100 mg/m2 d1＋替吉奥 60 mg bid d1～14，q21d）联合化疗2周期，后帕博利珠单抗单药治疗。

患者就诊本科时已分别送检两家公司（以下代称为A和B公司）进行NGS检测，送检标本分别为新鲜手术组织块＋全血（A公司）和石蜡包埋组织（B公司），采用的技术分别为WES（A公司）和TRS（B公司），送检情况和结果见表1。

2  NGS讨论

如前文所述，IHCC恶性程度高，对化疗不敏感，预后差，AJCC分期Ⅲ期患者5年生存率仅为10%[5,6]。NCCN指南推荐根据切除状态选择以氟尿嘧啶或吉西他滨为基础的辅助化疗联合或不联合放疗的方案尚未得到Ⅲ期临床数据的证实[7]；卡培他滨对比观察组对胆道肿瘤根治术后的研究中，虽然卡培他滨组中位总生存期有升高的趋势（51个月∶36个月），但在意向治疗人群分析中，其差异并未达到统计学意义[8]，并且该研究结果目前尚未发布。而目前临床应用较多的吉西他滨联合顺铂的方案也来自于晚期胆管癌研究[9]，并无辅助治疗人群相关研究证实。根据KEYNOTE028研究中期结果显示，24例PD-L1阳性的进展期胆道细胞癌患者使用帕博利珠单抗，其中4例患者达到部分缓解，4例患者处于疾病稳定状态，提示免疫治疗是IHCC治疗的潜在手段[10]。但目前抗PD-1/PD-L1单药有效率仅为10%～20%[11]。因而，笔者寄希望于NGS检测结果能提供靶向治疗的建议，增加治疗有效率。据文献报道，KRAS和TP53是较为常见的IHCC体细胞突变基因，发生率分别在9%～24%和3%～44%[12]，同其他消化道肿瘤一样提示不良的预后[13,14]。另约5%的IHCC患者存在BRAF突变，已有研究证实达菲替尼联合透明质酸酶对BRAF突变的IHCC患者治疗有效[15,16]。EGFR突变的发生率相对较低，约0%～7.4%，但厄洛替尼被证实可以提高包括IHCC在内的胆管癌中位无疾病生存期[17]。IDH1/2作为常见的IHCC突变基因，发生率约10%～28%[18]，IDH1抑制剂AG120在一个含IHCC的实体瘤Ⅰ期临床研究（NCT020273994）初期得到70%（7/10）的有效率[19]，另一个Ⅲ期的研究也正在进行中（NCT02989857）；而IDH2抑制剂AG-221也在一个Ⅰ期临床试验中显示不错的前景。EGFR基因的突变和融合在IHCC中较为常见，针对EGFR1/2扩增和EGFR3突变的BGJ398在Ⅰ期临床试验中显示出不错的安全抗肿瘤活性[20]，Ⅱ期研究也得到不错的初步结果[21]；同时，针对选择性EGFR抑制剂，如INCB54828（Incyte，NCT02924376），在包括IHCC在内的进展期实体瘤等正在早期临床试验阶段。此外，有研究显示ROS1融合突变在IHCC发生率为8.7%（2/23）[22]，克唑替尼等药物对IHCC患者是否有效需要进一步临床验证。

但患者并无上述或其他可靶向的基因位点出现，并且先后送检两次NGS检测结果除微卫星状态一致，TMB及检测出突变基因位点完全不同。为此，笔者将病例提请到本院消化内科NGS讨论会，邀请包括送检公司在内的多家测序公司进行讨论。

2.1 临床医生解读

2.1.1 A公司标本为取样3天后的新鲜组织标本，进行包含2.7万个基因的全外显子组测序，送检标本肿瘤组织≥20%。微卫星状态为MSS。肿瘤突变负荷（tumor mutational burben，TMB）为183个（7.69 Muts/Mb），根据该公司中国肿瘤患者数据库，各癌肿TMB以三分位数为界值，其中胆管癌界值为125，故认为本例样本属于高TMB，可从免疫治疗中获益，但该公司数据库中胆管癌患者数量不详，该界值对免疫治疗预测的敏感性暂不明确。此外，该样本检测到4个基因突变，均被认为是功能未明的驱动基因，并在报告的附件资料中对上述基因致病机制和相关文献进行具体描述。

2.1.2 B公司标本为取样10天后的石蜡包埋组织，进行324个基因的目标靶向测序，其中包含34个基因的内含子区域，1个基因启动子区域和1个非编码RNA。标本肿瘤组织比例不详（报告未说明）。报告显示微卫星状态为MSS，TMB为0 Muts/Mb。同时，本次检测也发现了4个临床意义未明的突变，但具体突变丰度和目前4个基因相关研究进展未做进一步说明。而在后续该平台进一步提供的数据和相关进展中，值得注意的是此报告中的BRAC突变，目前针对BRAC基因突变的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（Poly ADP Ribose Polymerase，PARP）抑制剂奥拉帕利，已经FDA批准作用于卵巢癌、乳腺癌等多个瘤种。但BRCA2 H523R突变仅是一个意义不明的变异，通过ClinVar网站检索发现81.8%（9/11）的平台检测结果认为该突变是良性（1/11）或可能是良性（8/11），因此该患者对奥拉帕利治疗获益的可能性较小。同时BRAC突变和CDH1突变为和遗传可能相关的基因，B公司基于对无遗传信息解读资质的考虑，报告中不区分突变是体细胞变异还是胚系变异。

就TMB而言， B公司作为FDA首批泛瘤种伴随诊断NGS产品，采用自主研发的算法，通过全面基因组测序分析计算TMB，被证实和全外显子测序TMB检测高度一致[23]。在采用该计算方法的研究中，有来自1456个肝单管细胞癌样本检测，中位TMB为2.5 Muts/Mb，大于20 Muts/Mb的仅有1.9%[23]，该患者计算所得TMB为0 Muts/Mb。该算法的一致性数据在ESMO大会上已经多次公布且被FDA批准，但是东西方人群在不同瘤种中的Cut-off值是否一致，还需要中国临床数据验证。A公司检测到183个突变（7.69 Muts/Mb），根据该公司的数据库，患者TMB高于数据库中胆管癌TMB上三分位数，这与B公司所得结果相差较大，但根据该份报告附件显示，其TMB数值的校正和换算正是对照了B公司发表的算法[23]。此外，两平台各自检出的4个基因突变完全不同，是存在检测错误或胚系突变过滤亦或是肿瘤异质性导致，我们无从得知。虽然就目前而言，上述突变均为临床意义未明突变，且已检测出PD-L1阳性的免疫获益提示尚不会对治疗方案的制定造成影响，但对两份报告出现差异的原因进行进一步探讨依然很有价值。

2.2 A公司解读 该样本采用包含2.7万外显子的WES检测，测序深度为200 X。进行WGS技术平行比较不同测序深度下肿瘤-对照样本成对的突变数量和类型之间准确性关系的研究，结果提示：当测序深度为30 X时，可检测绝大部分的突变；达到50 X的测序深度，检测到的突变数量和类型发生显著性差异；但当测序深度达到100 X时，可检测95%的突变，差异无统计学意义[24]。过分强调测序深度，还可能带来因测序产生的假阳性结果，增加测序错误的风险。并且本产品在进行全外显子测序前，也使用了测序深度更深的窗口（panel）进行验证，确保其准确性。

TMB最初即是通过WES和WGS对肿瘤基因组中编码区发生的非同义突变的数量进行定量而得，目前通过WES统计肿瘤组织非同义突变基因数量，预测可能产生的新抗原的数量是TMB检测的金标准[25]。市场上所有Panel所检测的TMB，主要通过与WES的TMB进行校准、建立一定的算法预测TMB值，但各Panel包含基因数目不同、数据库样本量差异大、所收集的数据来源于不同种族人群和癌种，各算法间相互独立，无法比较哪个算法更加准确。此外，随着各数据库样本量增加，TMB预测算法会发生偏移。A公司数据库目前收录了中国人群3000多例的肿瘤患者WES数据，根据不同瘤种TMB数据进行统计分析后，得到中国人群的各瘤种TMB阈值分布，如胆管细胞癌，在A公司数据库TMB参考阈值为125个突变（人类所有的两万多个基因中），为上三分位值为125，超过人群66.6%，即当胆管细胞癌患者体内发生突变基因数量超过125时，提示该患者可从免疫治疗中获益。

本产品对人类基因组上的9500个微卫星位点进行检测，基于Niu等[26]建立的MSI算法，对MSI结果进行判断。检测结果＜1%时，为MSS；检测结果1%～3.5%时，为MSI-Low；检测结果＞3.5%时，为MSI-High。该患者检测结果为0%，因此为MSS。

关于突变位点的检测，虽然通过测序深度高的Panel进行检测，尤其是对于突变频率较低的突变检测，准确性高[27]，但目前关于低频突变与临床治疗疗效之间的关系仍无定论。而WES可提供完整的临床相关基因突变谱。对肿瘤-对照样本对进行WES检测，可以了解患者的全部遗传信息，但目前明确与遗传性肿瘤相关的基因突变只有40个左右。本着遵循隐私保护、知情同意和保护患者利益等伦理原则，在开展基因检测前，我们会仔细询问患者是否有肿瘤家族史，经患者知情并同意后，公司才会出具遗传报告，否则存在披露患者遗传信息的嫌疑。该患者并无肿瘤家族史，本次对患者白细胞进行检测后，发现的都是临床意义未明突变的胚系突变，与遗传肿瘤无明确关系，所以本份报告未描述。

除基因突变检测外，我们还进行了染色体拷贝数变异（copy number variations，CNVs）检测。所有肿瘤都可能会发生染色体数量或结构改变，即体细胞拷贝数变异（somatic copy number alter­ations，SCNA。作为导致肿瘤发生的重要因素之一，SCNA易导致瘤内异质性，促进肿瘤增殖，使肿瘤产生高度的侵袭性，并有耐药性和预后差的特点。有研究显示，SCNA与肿瘤增殖和免疫逃逸相关[28]。目前，SCNA的临床应用包括SCNA抑制和SCNA诱导两个方向：前者通过抑制细胞周期，如CDKi和APCi，抑制染色体不稳定（chromosomalinstability，CIN）阳性肿瘤细胞中导致染色体异常分离或结构改变等异常的过程，以减缓或阻止SCNA发生，达到治疗目的；后者主要通过诱导产生更多的CIN，如Paclitaxel、AURKAi等，导致细胞凋亡。但SCNA与免疫细胞浸润和免疫检测点抑制剂之间的关系尚未明确[29]。与单核苷酸变异相比，CNV更具备提示预后的意义，拷贝数异质性高于中位数的非小细胞肺癌患者无疾病生存期更差，无论分期、疾病再发或死亡的风险都会增加[30]。该样本检测到Chr.17q扩增和Chr.14q缺失，属于染色体臂变异。根据肿瘤发生的阶段划分，该患者应该属于染色体臂变异驱动肿瘤的发生，促进免疫逃逸，但暂无证据患者可以从上述治疗中获益。

2.3 B公司解读 该样本采用NGS大panel检测，平均测序深度＞500 X。TMB计算采用自主研发算法，计算每兆碱基中体细胞突变的数目，即TMB＝次要等位基因频率（minor allele frequency，MAF）大于等于5%的体细胞突变个数/靶向基因组大小。算法包含所有编码区单点置换和短片段缺失突变，同时包含同义突变和非同义突变，且根据遗传多态性公共数据库及公司内部数据库过滤了胚系突变。该样本检测出4个MAF≥5%的突变（均为VUS突变），但经过算法预测，4个突变均为胚系突变，不纳入TMB计算，因此符合计算TMB的突变个数为0，即TMB为0 Muts/Mb。虽然WES是检测TMB的金标准，但对检测使用的平台要求也较高，只有经过系统性能验证的WES平台才能保证检测结果的准确性。本平台TMB算法与经过系统性性能验证的WES计算的TMB高度一致，且具有高准确性、精确性、可再现性和可重复性。在2018年ESMO上公布的最新分析验证数据表明，本平台计算的TMB与WES平台计算的TMB一致性达到86%，可重复性和可再现性分别达到97.3%和95.3%。

本报告不用于预测肿瘤的遗传易感性（如结直肠癌遗传易感基因APC）或者基于胚系突变的用药指导（如BRCA1/2的胚系突变），因此未做体细胞突变和胚系突变的描述——平台利用自主研发的算法可预测胚系突变，经验证该算法预测准确性≥95%[31]，但从产品定位的角度考虑，检测报告不区分胚系/体系突变。

进行微卫星状态评估时，我们选取了95个读长为10～20 bp的微卫星位点，以最大化的涵盖样本间差异。10～20 bp的微卫星位点可以确保涵盖在NGS的读长内，也可以确保高比例DNA聚合酶的结合及滑动。该算法与传统PCR检测和免疫组化的方法比较，一致性达到97%，特异性达到95%[32]。

此外，本报告检出的4个基因变异均是临床意义未明的变异，其MAF分别为50.92%、48.64%、48.67%、50.21%。如前所述，本产品不区分体细胞变异和胚系变异，经实验室算法预测4个变异均为胚系变异。A公司检测出了4个基因变异，MAF分别为11.40%、6.19%、6.80%、7.59%。本产品覆盖该4个基因，报告未检出该4个基因存在变异, 该4个变异经本平台实验室核实确实不存在。针对该4个变异两家平台检测结果完全不同，A公司WES检出的该4个基因变异MAF不高，不排除假阳性的可能。可用第三方平台（比如数字PCR）做进一步验证。

3 总结

对于一份NGS报告，临床医生在核实患者基本信息和标本来源（组织标本或外周血标本）后，首先应关注样本质量的把控，包括采样时间、标本类型（新鲜组织标本、石蜡包埋组织、细胞学标本、全血）、肿瘤细胞比例。一般情况下，用于NGS检测的组织标本中肿瘤细胞核比例建议至少达到20%。由于存在石蜡包埋组织DNA/RNA降解的可能性，新鲜组织标本无疑是为最理想的，但由于实际条件限制，多数送检的仍是石蜡包埋组织，也有平台表明其对石蜡包埋组织标本检测也能达到极高的准确度[33]。

MSI-H/dMMR、TMB是较为明确的免疫治疗疗效预测指标[34-36]。目前PCR仍是检测MSI的“金标准”，但对组织样本量的要求、检测时长、检测费用等因素限制了其在临床的广泛使用，而NGS对MSI的检测逐渐得到大家的认可[37-39]，但具体检测位点，各平台并无统一标准。根据TMB的定义（即肿瘤样本全基因组去除胚系DNA变异后体细胞突变数目），全外显子组测序应是最为准确的检测方法，但近年来也有一些研究证实了检测数百个基因的panel通过一些计算也能得到和WES检测一样准确的结果[23,40,41]。介于WES的价格原因，多数平台采用后者进行检测计算，但对TMB的算法和界值也并没有统一的标准。可靶向的基因突变也是临床医生最为关注的内容之一，截至2017年FDA已经批准了80多种肿瘤靶向药物[42]。为了充分利用这些靶向药物，“篮子研究”（basket study）应运而生[43]，希望达到异病同治的效果，延长肿瘤患者生存时间；并且该研究已经取得不错的成果[44]，NGS无疑是这条道路上最有利的工具。

随着基因测序深度和广度的增加，更多的基因突变被发现，各家公司也基于自己检测手段和生信分析，并根据公共数据库（COSMIC、TCGA等）和平台积累的数据以及一些软件计算做出判断，通常报告呈现的是第1、2、3类基因突变，也就是确定致病的、可能致病的和意义未明的基因突变，较为有争议的是第3类突变，尤其是目前各平台所引用的多为国外数据库，其中中国人甚至亚洲人所占比例相对较小，是否能一概而论目前无从得知，但尽快完善中国人的基因数据库势在必行。

随着2017年FDA对来自商业和学术机构的医学NGS服务的认可，NGS正式进入临床实践。但目前国内NGS缺乏统一规范和检测标准，导致不同实验室平台检测结果无法比较。2017年，国家卫生计生委临检中心对全国136家测序平台进行肿瘤体细胞基因突变高通量测序平台生物学分析能力评价，两次质评合格率分别为34.5%（39/113）、65.5%（74/113），全部正确的实验室仅为49.6%（56/113）。

正如Hayer博士所说：“一次糟糕的肿瘤标志物检测带来的后果和糟糕的药物一样”[45]。目前除需动态监测患者肿瘤突变情况外，大部分患者仅接受1次NGS检测，但取自同一患者的两份完全不同的NGS报告并不是罕见现象，不是每一次的结果都能用时间异质性和空间异质性来解释。2017年发表在JAMA上的一篇文章，对比了两家业界顶尖公司同时检测的34例患者的有效ctDNA样本，仅35%（12/34）检测报告结果相同[46]。在本科进行的12次NGS讨论中，有3次是讨论不同平台检测结果的差异。随着NGS检测的日益普及，如果没有统一的标准和规范来保证检测结果的可靠性，那么无论对患者还是临床医生都是灾难。

通过临床观察，就消化系统而言能通过NGS检测筛出靶向基因的概率并不高，但MSI、TMB对免疫治疗发挥极大指导作用。如果NGS结果出现问题，对患者不仅是金钱上的损失，更可怕的是对最佳治疗时间的延误、对生存期的影响。尤其是目前基因检测由于时间、空间的异质性，某些检测结果无法溯源，这也对各平台的专业能力提出更高的要求。同时，也需要加强肿瘤临床医生对NGS结果的辩证意识。

总的来说，本文报道了一例送检两家公司进行NGS检测的肝内胆管细胞癌患者，并从不同角度解读了NGS报告，初步探索了NGS报告解读方法，并发现了目前国内NGS检测存在的部分问题。完善NGS检测规范、结果判读标准、建立中国人的基因数据库是解决问题的关键，联合临床科室、病理科和NGS检测公司进行讨论的形式可加速目标的达成，也能协助肿瘤医生更准确地制定治疗方案。

参考文献（略）